微波辐射合成小檗红碱的工艺研究

刘丽贤，袁 晓，高 英，周东斌，李卫民

1广州中医药大学中药学院，广州510006;2广州牌牌生物科技有限公司，广州510000;3广州中医药大学新药中心，广州510006

小檗碱(Berberine，BBR)与小檗红碱为异喹啉生物碱，均具有抗微生物、抗肿瘤、降压、抗心律等作用［1，2］。此外，BBR 还具有降糖、治疗阿尔茨海默病等多种药理活性［1］，但因溶解性差及生物利用度低，制约其临床应用。BBR结构中不存在制备前药的“抓手”，如羟基(-OH)、羧基(-COOH)等基团，而高温下小檗碱(C9-CH3)易脱甲基生成小檗红碱(C9-OH)。为此，小檗碱C-9位的修饰，大部分以小檗红碱为中间体进一步衍生，其衍生物具有抗肿瘤，抗 HIV 等多种活性［3，4］。

目前，小檗红碱传统合成方法是真空热解法。Jwasa K［3］将 BBR 在真空 190 °C 加热 15 min，粗品用乙醇/甲醇重结晶，产率69%;而 Hardik S［4］等，则反应1～2 h，粗品用氯仿/甲醇9∶1硅胶柱层析，产率90%。本课题组对上述反应方法进行重现，未经纯化，产率约为84%。

其次也有2篇微波法合成的报道。2002年，Das［5］等首次提出微波合成法，以氧化铝浴中微波反应5 min，收率98%。2010年，张明晓［6］等则直接将BBR放入微波炉中600W反应5 min。本课题组通过重现试验发现，按方法［6］即使反应1 h，BBR也基本不发生转化;而方法［5］的重现结果则是BBR受热十分不均，往往只有局部发生转化，或局部反应过剧而碳化，未能达到98%的收率。

由此可见，现时的微波合成法虽比真空热解法节能省时，但两种方法均存在受热不均、产物纯度低，产率低的问题。为此，本课题组创新选择高沸点稳定的极性介质DMF为溶剂，采用微波法合成小檗红碱，具有受热均匀，反应时间短，产物纯度、产率高，纯化方法简单等优点。

1 材料与方法

1．1 仪器与试剂

微电脑微波化学反应器WBFY-201(800W)，有机合成装置，隔膜真空泵YH-700，X-5显微熔点测定仪，低温冷却循环泵DLSB-5/25(均购于巩义市予华仪器有限责任公司);HITACHI高效液相色谱仪(含HITACHI 1110泵，1410紫外检测器，1210自动进样器);UV-1601紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司);Bio-Rad Merlin红外谱仪;Agilent 1100 LC/MSD系统;AVANCE-300超导核磁共振仪(德国BRUKER公司);分离纯化系统Dr Flash-S(江苏利穗科技);PiPo-02大孔树脂(广州牌牌生物科技有限公司);盐酸小檗碱(BBR，96%);小檗红碱对照品(自制，≥98%);N，N-二甲基甲酰胺(DMF，天津市富宇精细化工有限公司);其他试剂均为分析纯。

1．2 实验方法

1．2．1 反应原理

1．2．2 实验步骤

在圆底烧瓶中加入一定量料液比为1∶25(g∶mL)的BBR和DMF，数颗沸石，回流冷凝，在400 W 微波辐射下，反应15 min。取出反应瓶，趁热加入1．5倍水稀释冷却，冷藏过夜，使析晶完全，抽滤，干燥，得红色针晶，收率约72%;滤液另以PiPo-02大孔树脂柱分离，依次用 40%、45%、50%、55%、60%、65%及70%甲醇洗脱，收集70%甲醇洗脱部位，浓缩，得红色针晶，收率约21%;产品总收率约93%，纯度≥98%。

1．2．3 单因素实验

1．2．3．1 反应功率的考察

在100 mL圆底烧瓶中加入数颗沸石，小檗碱100mg(0．27mmol)，DMF 5mL，即料液比为1∶50(g∶mL)，分别在 240、400、640、800 W 微波辐射下，回流冷凝15 min，反应重复3 次，按“1．2．6”项下计算产量及产率，取平均值。

1．2．3．2 料液比的考察

在250 mL圆底烧瓶中加入数颗沸石，小檗碱1 g(2．69 mmol)，分别加入 DMF 5、10、15、20、25、30、50 mL，400W 微波辐射下(即“1．2．3．1”项下的最佳反应功率)，回流冷凝15 min，反应重复3次，按“1．2．6”项下计算产量及产率，取平均值。

1．2．3．3 反应时间的考察

在250 mL圆底烧瓶中加入数颗沸石，小檗碱1 g(2．69 mmol)，DMF25 mL，即“1．2．3．2”项下的最佳料液比1∶25(g∶mL)，400W 微波辐射下，回流冷凝，分别反应 5、10、15、20、25、30 min，反应重复 3次，按“1．2．6”项下计算产量及产率，取平均值。

1．2．4 HPLC分析条件及方法学考察

1．2．4．1 色谱条件

YMC-Pack ODS-AQ色谱柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm);流动相:乙腈-0．2%甲酸水溶液(25∶75);柱温:30°C;流速:1 mL/min;检测波长:265 nm。在此条件下，小檗碱与小檗红碱的色谱峰可达基线分离，分离度大于1．5。对照品、反应物HPLC色谱图见图1。

1．2．4．2 对照品的制备

分别精密称取小檗碱及小檗红碱对照品25．0 mg置于200 mL量瓶中，以甲醇定容，配成浓度为0．125 μg/μL 的对照品液。

1．2．4．3 供试品的制备

①100 mg BBR反应液:往反应液加入适量甲醇，超声溶解，补加甲醇定容至20 mL，摇匀，吸取5 mL转移至200 mL量瓶定容，摇匀，即得。②1 g BBR反应液:往反应液加入适量甲醇，超声溶解，补加甲醇定容至200 mL，摇匀，吸取5 mL转移至200 mL量瓶定容，摇匀，即得。

1．2．4．4 标准曲线制备

吸取小檗红碱对照品 2、4、6、8、10 μL 进样，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制工作曲线。

1．2．4．5 精密度试验

取小檗红碱对照品，进样6μL，连续6次，测定小檗碱与小檗红碱峰面积，计算RSD。

1．2．4．6 稳定性试验

取檗红碱对照品，在 0、2、4、8、16、24、48 h，分别进样6μL，测定小檗红碱峰面积，计算RSD。

1．2．4．7 重复性试验

投料小檗碱 1 g，按“1．2．2”项下方法反应及“1．2．4．3”项下方法制备供试品6 份，进样6 μL，测定峰面积计算小檗红碱含量，计算RSD。

1．2．4．8 样品含量测定

反应液按“1．2．4．3”项下方法制备供试品溶液，进样6μL。按标准曲线法以峰面积计算小檗红碱的含量。

1．2．5 结构鉴定

对纯化产品采用 UV、IR 、ESI-MS、1H NMR、13C NMR进行结构表征。

1．2．6 产率的计算

产物产率y=产品实际质量/产品理论质量×100%

式中:产品实际质量按“1．2．4．8”项下方法测定;产品理论质量=(W×96% ×M1)/M2，W为小檗碱投料量，M1、M2分别为小檗红碱、小檗碱的摩尔质量。

2 结果与讨论

2．1 单因素实验

2．1．1 辐射功率对产率的影响

由表1可知，随着微波功率的增大，产率逐渐提高，增到400 W达最大，后产率逐渐下降，故选用400 W功率辐射。

表1 微波辐射功率对产率的影响Table 1 Effect ofmicrowave power on yield of berberrubine

2．1．2 料液比对产率的影响

由表2可知，随着DMF溶剂量的增大，产率逐渐提高，增到 BBR∶DMF=1∶25(g∶mL)达最大，后产率基本平稳，这是因为BBR在该比例的热DMF中可完全溶解，故选用料液比1∶25(g∶mL)反应。

2．1．3 反应时间对产率的影响

由表3可知，随着微波辐射时间的增加，产率逐渐提高，辐射15 min时产率达最大，而后产率趋于稳定。这是由于反应已基本达到平衡所致，故选用辐射15 min为宜。

表2 料液比对产率的影响Table 2 Effect of the solid-liquid ratio on yield of berberrubine

表3 微波辐射时间对产率的影响Table 3 Effectofmicrowave radiation time on yield ofberberrubine

2．2 与真空热解法的比较

按文献［4］操作，并考察了不同的反应时间对产率的影响，见表4。由表4可见，当反应时间为1 h时，基本稳定，最高产率为83．9%，而微波法最高产率是98．4%，反应时间为15 min，与真空热解法相比，微波法产率提高近15%，反应时间缩短近4倍。

表4 真空热解时间对产率的影响Table 4 Effect of vacuum pyrolysis time on yield of berberrubine

2．3 HPLC分析及方法学考察结果

2．3．1 对照品及反应物的HPLC图

图1 小檗碱(A)、自制小檗红碱对照品(B)及反应物(C)的 HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of berberine standard(A)，internal berberrubine standard(B)and the crude reaction product(C)

2．3．2 标准曲线制备

小檗红碱回归方程:y=3887678．8x-21327．3，r=0．9999，线性范围为0．253 μg～1．254 μg。

2．3．3 精密度试验

以峰面积计算，小檗红碱RSD为0．68%，表明精密性良好。

2．3．4 稳定性试验

以峰面积计算，小檗红碱的 RSD为2．44%，表明它们在48 h内稳定。

2．3．5 重复性试验

含量计算小檗红碱平均 RSD分别为1．40%，表明重现性好。

2．4 结构表征

小檗红碱 红色针晶(MeOH);mp．280．3 ～281．5℃;UV(MeOH)λmax232，271，351，440 nm;IR(KBr)νmax3408(s，-OH)，1250 cm–1(vs，C-O);ESIMS m/z 322．2 ［M-Cl］+(calcd for C19H16NO4，322.2);1H NMR(CDCl3，300 MHz)δ:7．35(1H，s，H-1)，6．76(1H，s，H-4)，3．04(1H，t，J=5．8 Hz，H-5)，4．53(1H，t，J=5．8 Hz，H-6)，9．20(1H，s，H-8)，6．83(1H，d，J=9．1 Hz，H-11)，7．46(1H，d，J=9．1 Hz，H-12)，7．97(1H，s，H-13)，5．95(1H，s，H-15)，3．81(1H，s，H-16);13C NMR(CDCl3，75 MHz)δ:106．27(C-1)，121．81(C-1a)，151．42(C-2)，149．97(C-3)，109．14(C-4)，131．16(C-4a)，57．04(C-6)，143．72(C-8)，134．21(C-8a)，147.84(C-9)，147．84(C-10)，120．21(C-11)，123．21(C-12)，131．16(C-12a)，124．22(C-13)，136．23(C-14)，103．68(C-15)，55．94(C-16);与文献［5，7］基本一致。

3 讨论

小檗红碱的合成一直以真空热解法为主，由于真空热解法，是固体直接反应，易受热不均，产物纯度较低，重现试验收率80%左右。而应用微波合成法的研究报道仅有两篇［5，6］。本课题组对微波法的两篇文献也进行了重现试验，按文献［6］操作，BBR直接微波5 min后，根本没发生转化，即使延长时间也不能顺利转化;按文献［5］，加入氧化铝做热传导介质后，反应5 min也只有极少量的BBR发生转化;延长反应时间至10 min，局部BBR发生转化;而反应15 min则有碳化现象，存在很明显的受热不均的问题。

由于BBR转化小檗红碱的临界温度在160℃左右，而微波辐射在极性介质中效率高，为此本课题组选用高沸点稳定的极性溶剂DMF作为反应介质，进行辐射反应。本课题组也曾尝试以低成本的水作为溶剂，但发现以水为介质并不能达到热解温度，BBR不转化。另外，也尝试了以DMSO为溶剂，但反应液产物复杂，可能因DMSO高温下易分解所致。

4 结论

本文首次以DMF为反应介质微波合成小檗红碱，较系统地考察了反应功率、反应时间、料液比三个影响因素，并与传统的真空热解法进行了比较，相对于真空热解法而言，微波法具有快速、节能、产率高的优点，为制备小檗红碱提供了一种新的合成途径。

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5 Das B，Srinivas K．Conversion of Berberine into berberrubine by selective demethylation undermicrowave irradiation．Synth Commun，2002，32:3027-3029．

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