复方清热颗粒对多重耐药阴沟肠杆菌主动外排泵影响的药敏试验*

陈玉娇 任爱民 王 红 张淑文

（首都医科大学附属北京友谊医院，北京 100050）

复方清热颗粒对多重耐药阴沟肠杆菌主动外排泵影响的药敏试验*

陈玉娇 任爱民 王 红 张淑文

（首都医科大学附属北京友谊医院，北京 100050）

目的观察中药复方清热颗粒对多重耐药阴沟肠杆菌（Ecl）主动外排泵机制的影响。方法（1）含药血清的制备：选购健康大耳白兔，随机分为两组，试验组6只和空白对照组6只，适应性喂养1周。实验组予以无菌复方清热颗粒剂药液灌胃，每日2次，连续给药5 d；对照组予同等体积灭菌蒸馏水灌胃相同时间及给药次数。末次给药后60 min，无菌心脏采血，分离含药血清和空白血清，于-20℃保存备用。（2）应用外排泵抑制剂碳酰氰基-对-氯苯腙（CCCP）筛选出外排泵表型阳性多重耐药Ecl 10株，利用琼脂对倍稀释法测出环丙沙星，对上述Ecl的最小抑菌浓度（MIC）值，并用同样方法测出含药血清、空白血清、复方清热颗粒、CCCP及分别联合环丙沙星对上述10株Ecl的最小抑菌浓度（MIC）值变化。结果复方中药清热颗粒含药血清可降低环丙沙星对多重耐药EclMIC值。结论中药复方清热颗可抑制多重耐药Ecl的耐药情况。

阴沟肠杆菌 主动外排泵 复方清热颗粒

阴沟肠杆菌（Ecl）是一种重要的临床条件致病菌，其所致感染约占肠杆菌属感染的65％～75％［1］，主要引起菌血症，呼吸道、泌尿道等感染。近年，由于长期和不合理广谱抗生素的使用，多重耐药（MDR）Ecl的出现越来越普遍［2］，导致ICU感染病死率增加，给临床治疗带来了极大困难［3］。本院中药复方清热颗粒由蒲公英、败酱草、虎杖、半枝莲组成，具有清热解毒和泻下等功效。多项研究表明复方清热颗粒具有抗菌活性，可以改善耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌等的耐药性［4-5］。本实验在前期研究基础上，继续探讨复方清热颗粒能否改善多重耐药Ecl的耐药情况。

1 材料与方法

1.1 动物 健康大耳白兔12只，体质量1.8～2.5 kg，购自中国医学科学院医学实验动物研究所，实验前均适应性喂养1周。

1.2 菌株 实验组菌株为2009年至2013年北京友谊医院微生物室菌库保存的临床分离多重耐药Ecl菌株，均对青霉素类、氨基糖苷类及喹诺酮类抗生素耐药，共13株；标准质控菌株大肠埃希菌ATCC25922，EclATCC13047，为友谊医院检验中心微生物室保存菌株。

1.3 药物 环丙沙星（CIP）：购自中国食品药品检定研究院，批号13045-201203，用无菌去离子水配成浓度为2.56 mg/mL的储备母液，过滤除菌，于-20℃保存备用；中药复方清热颗粒剂（蒲公英、败酱草、黄芪、半枝莲等）：由北京康仁堂药业有限公司按指定药方比例加工合成。

1.4 试剂与设备 碳酰氰基-对-氯苯腙（CCCP）：美国Sigma公司，C2759-100MG；二甲基亚砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO），北京索来宝科技有限公司，200-664-3；血琼脂培养基，生物梅里埃（法国）公司；MH琼脂粉，批号1136737，OXOID有限公司。VITEK全自动微生物分析系统，生物梅里埃（法国）公司；光电比浊仪，生物梅里埃（法国）公司；电热恒温培养箱DH6000AB型，天津市泰斯特仪器有限公司。

1.5 血清制备 （1）复方清热颗粒含药血清的制备：随机分为试验组与空白对照组各6只，适应性喂养1周。将复方清热颗粒用无菌去离子水溶解，试验组每日予10倍临床剂量复方清热颗粒剂药液 ［22 g/（kg·d）］灌胃，每日2次，连续5 d；第5日末次给药后1 h，无菌心脏采血，4000 rpm×10 min离心，分离含药血清后混合，-20℃冰箱保存备用。（2）空白血清的制备：选空白对照组6只健康大耳白兔，每天予灭菌蒸馏水［40 mL/（kg·d）］灌胃，每日2次，连续5 d；5 d后心脏采血，离心得空白血清，-20℃保存备用［5］。

1.6 外排泵表型阳性MDREcl的筛选 临床分离的多重耐药Ecl 13株，分别挑取单个菌落平板三区划线于血琼脂培养基中，35℃恒温培育箱中培养18 h时，然后分别挑取单菌落，用无菌生理盐水稀释，比浊仪调节菌液浓度值至0.5麦氏浓度（约108CFU/mL），再依次稀释至104CFU/mL。同法配制EclATCC13047作为质控。分别配制含不同浓度CIP和CIP+CCCP的MH琼脂平板，抗生素和培养液按1∶9比例配制，CIP终浓度分别为0.125，0.25，0.5，1，2，4，8，16，32，64，128，256 μg/mL，CCCP终浓度为2.56 μg/mL（该质量浓度对细菌外排泵有较好抑制作用，且对细菌生长无影响［6］）。将13株MDR-Ecl分别接种于已配制好的含不同浓度CIP和含不同浓度CIP+CCCP的MH琼脂平板中，细菌接种量为104CFU/mL，35℃恒温培育箱中培养18 h，采用琼脂对倍稀释法测出各组CIP的MIC值，并设一空白对照组和只含2.56 μg/mL CCCP的阴性对照组。以含CCCP时CIP的MIC值较不含CCCP的MIC值降低≥4倍作为外排泵表型阳性判读标准［7］。共筛选出10株外排泵表型阳性的MDR-Ecl，分别为E1～5、E8、E10～13，P＝0.01，差异有统计学意义（P＜0.05）。空白平皿及只含2.56 μg/mL CCCP的MH平板上细菌生长良好。具体MIC值见表1，图1。

表1 应用CCCP前后CIP对MDR-Ecl的MIC值变化（μg/mL）变化（P＝0.01）

图1 CIP和CIP+CCCP对MDR-Ecl MIC值（μg/mL）变化（P＝0.01）

1.7 外排泵表型阳性MDR-Ecl药敏试验 分别测定空白血清、含药血清、中药复方清热颗粒、中药+CIP、空白血清+CIP、含药血清+CIP及中药+CIP+CCCP等不同药物组成对外排泵阳性MDR-Ecl的MIC值变化，以Ecl ATCC13047为质控菌株。结果按CLSI 2012版标准判读［8］。（1）含药血清及空白血清的MIC值测定：配制20 mL含药血清及空白血清MH琼脂平皿，含药血清及空白血清含量分别为0.5 mL、1 mL、2 mL、4 mL。分别接种上述外排泵表型阳性的多重耐药Ecl菌悬液及质控菌株菌悬液于含药血清及空白血清MH琼脂平皿中，细菌接种量约为104CFU/mL，于35℃恒温箱培育18 h。上述4个含药血清及空白血清MH琼脂平皿上的Ecl菌菌株均生长良好，未测出含药血清及空白血清的MIC值。（2）中药复方清热颗粒MIC值测定：用电子天平准确称取 2g复方清热颗粒，先用少量DMSO（占总体积＜1％）溶解，加入10 mL无菌去离子水中，使之充分溶解，过滤除菌备用。配制含中药复方清热颗粒的MH琼脂平皿，中药终浓度分别为：0.625、1.25、2.5、5、10、20 mg/mL。分别接种上述外排泵表型阳性MDR-Ecl菌悬液及质控菌株菌悬液约104CFU/mL，并于35℃恒温箱培育18 h后测定CIP的MIC值。当中药原液浓度为20 mg/mL时，所有菌株均无生长；在中药原液终浓度为0.625 mg/mL的MH培养平板中，可见各菌株均有生长。记录不同浓度复方清热颗粒MIC值见表2。（3）测定。

表2 复方清热颗粒（mg/mL）对MDR-Ecl的MIC值

1.8 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件。计量数据以（±s）表示，采用配对t检验方法进行统计学处理。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 中药+CIP组MIC值 见表3，图2。结合（2）试验结果，制备含中药复方清热颗粒和CIP的MH琼脂平皿，分为4组，每组CIP的质量终浓度均分别包括：0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256 μg/mL，中药终浓度分别为：0.625、1.25、2.5 mg/mL。接种各细菌菌悬液及质控菌株悬液并于恒温箱中培育，具体试验方法同上。CIP组和CIP+中药0.625 mg/mL组、CIP组和CIP+中药1.25 mg/mL组MIC值相当（P＞0.05），CIP组和 CIP+中药 2.5 mg/mL组 MIC值下降（P＜0.05）。

表3 复方清热颗粒（mg/mL）作用下CIP的MIC值（μg/mL）

图2 CIP和CIP+复方清热颗粒（2.5 mg/mL）的MIC值变化（μg/mL）（P＝0.015）

2.2 空白血清+CIP组、含药血清+CIP组MIC值 见表4，图3。分别配制含空白血清+CIP组和含药血清+CIP组MH琼脂平皿，空白血清体积为2 mL（1组），含药血清体积分别为：0.5 mL、1 mL、2 mL（命名为2、3、4组），CIP终浓度分别为1、2、4、8、16、32、64、128、256 μg/mL。分别接种上述菌悬液及质控菌株菌悬液于MH琼脂平皿，细菌接种量及培育时间同上。CIP组、空白血清+CIP组、含药血清+CIP组MIC值比较，差异无统计学意义（P＜0.05）。

表4 应用空白血清、含药血清前后CIP对MDR-Ecl的MIC值变化（μg/mL）（P＞0.05）

图3 应用空白血清、含药血清前后CIP对MDR-Ecl的MIC值变化（μg/mL）（P＞0.05）

2.3 中药复方清热颗粒＋CCCP＋CIP组MIC值 见表5，图4。制备MH琼脂平皿，每个MH琼脂平皿中复方清热颗粒的终浓度均为 2.5 mg/mL，CCCP的浓度为2.56 μg/mL，CIP质量浓度分别为1、2、4、8、16、32、64、128 μg/mL。同样试验方法进行细菌接种及恒温孵育。CIP+CCCP组与中药+CIP+CCCP组MIC值比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表5 复方清热颗粒剂+CIP+CCCP组CIP的MIC值（μg/mL）（P＝0.031）

图4 CIP+CCCP和CIP+CCCP+复方清热颗粒2.5 mg/mL时CIP的MIC值（μg/mL）

3 讨论

近年国内外越来越多研究发现，Ecl细菌外膜上存在特殊的AcrAB-TolC主动外排泵系统，能将进入菌体内的药物不断排出，使菌体内的药物浓度降低从而导致耐药。由于主动外排泵系统作用底物广泛，故被认为是细菌产生耐药性尤其是多重耐药的重要原因。外排泵抑制剂（EPIs）可以逆转细菌对抗生素的敏感性，成为改善细菌耐药的途径之一。但这些抑制剂目前大多仍处于试验阶段，许多在体外活性良好的外排泵抑制剂由于安全性、特异性以及机制尚不明确等诸多原因而未应用于临床治疗，因而研发新型外排泵抑制剂或其他途径逆转细菌耐药性的药物成为趋势［9］。

本文从中医学角度出发，探讨中药对细菌主动外排泵作用的影响。实验以多重耐药Ecl为实验菌株，中药复方清热颗粒及其含药血清为主要研究对象，主要观察在分别联合含药血清、中药复方清热颗粒及CC-CP前后环丙沙星（CIP）的MIC值变化。通过分析结果可以发现：（1）空白血清组、含药血清组为测得最小抑菌浓度，其分别联合CIP后MIC值变化差异无统计学意义，均说明含药血清不能改善Ecl的耐药性；（2）CIP＋中药复方清热颗粒组与单用CIP组比较，加入中药复方制剂后CIP的MIC值明显下降（P＜0.05），说明一定浓度复方清热颗粒具有抑菌效果，且与西药联合后能明显改善外排泵阳性多重耐药Ecl对环丙沙星的耐药情况。（3）中药＋CIP＋CCCP组MIC值较CIP＋CCCP组MIC值显著下降（P＜0.05），说明当CCCP阻断外排泵能量来源后，中药原液仍可以通过其他作用机制改善环丙沙星耐药情况，既往研究显示复方清热颗粒对耐药细菌外膜通透性具有干预作用，使外膜蛋白含量增加从而降低细菌耐药性［10］，可能与中药干扰外膜通透性机制有关。

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［2］Manzur A，Tubau F，Pujol M，et al.Nosocomial outbreak due to extended spectrum b-lactamase-producing Enterobacter cloacae in a cardiothoracic intensive care unit［J］.J Clin Microbiol，2007，45（6）：2365-2369.

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［4］于一云，王红，张淑文，等.复方清热颗粒剂对MRSA PBP2a表达影响的实验研究［J］.中国中医急症，2009，18（9）：1483-1486.

［5］杨钧，张淑文，阴宏，等.复方清热颗粒剂含药血清对超广谱-内酰胺酶的抑制作用［J］.中国实验方剂学杂志，2007，13（11）：40-43.

［6］Yang FC，Yan JJ，Hung KH，et al.Characterization of ertapenem-resistant enterobacter cloacae in a taiwanese university hospital［J］.Journal of Clinical Microbiology，2011，doi：10.1128/JCM.01263-11.

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［9］马真，蔡绍曦，佟万成.耐碳青霉烯类Ecl外排泵AdeABC的研究［J］.南方医科大学学报（J South Med Univ），2011，31（8）：1378-1381.

［10］王静，张淑文，王红，等.复方清热颗粒剂对耐药大肠杆菌外膜通透性的干预作用［J］.中国中医急症，2009，11（18）：1845-1848.

Vitro Medicine Sensitive Experiments about Compound Qingre Granules on Efflux Pumps of Multidrug-resistant Enterobacter Cloacae

CHEN Yujiao，REN Aimin，WANG Hong，et al.Beijing Friendship Hospital，Capital Medical University，Beijing 100050，China

Objective：To explore the effect of Compound Qingre Granules on efflux pumps of multidrug-resistant enterobacter cloacae.Methods：Ⅰ.The preparation of drug serum：healthy rabbits with big ears were selected and randomly divided into two groups：6 in experimental group and 6 in control group.After one week of adaptive feeding，experimental group was given Compound Qingre Granules by intragastric administration twice a day for 5 days.The control group was given sterile purified water in the same way with the same dose.Blood was drawn from heart after 60 minutes at the last medication and was centrifuged to separate drug serum and blank serum，which were then conserved in-20℃.Ⅱ.10 strains of efflux pump positive multidrug-resistant enterobacter cloacae were selected by using CCCP.The minimal inhibitory concentration of ciprofloxacin was measured within and withiout Compound Qingre Granules，drug serum，blank serum and CCCP by agar dilution method.Results：Compound Qingre Granules could significantly reduce the MIC of ciprofloxacin to multidrug-resistant enterobacter cloacae.Conclusions：Compound Qingre Granules can alleviate the resisitance of multidrug-resistant enterobacter cloacae.

Enterobacter cloacae；Efflux pump；Compound Qingre Granules

R285.5

A

1004-745X（2014）08-1460-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.08.025

2014-05-19）

北京市中医药管理局重点学科基金（京中医科字【2012】250号）