通腑泻肺方对脓毒症急性肺损伤大鼠NLRP3调控作用的实验研究*

张 涛 熊旭东 赵 敏

（上海中医药大学附属曙光医院，上海 200021）

通腑泻肺方对脓毒症急性肺损伤大鼠NLRP3调控作用的实验研究*

张 涛 熊旭东△赵 敏

（上海中医药大学附属曙光医院，上海 200021）

目的观察通腑泻肺方对脓毒症急性肺损伤大鼠NLRP3炎性体表达的影响，探索通腑泻肺方治疗脓毒症急性肺损伤的作用机制。方法采用盲肠结扎穿孔法（CLP）复制脓毒症急性肺损伤动物模型。将32只清洁级健康成年雄性SD大鼠随机分为空白对照组、假手术组、模型组和治疗组，每组8只。空白对照组麻醉后腹主动脉采血致死；假手术组麻醉后开腹，翻动胃肠后关腹，24 h后麻醉并腹主动脉采血致死；模型组于CLP后立即予生理盐水2 mL灌胃1次，CLP后6 h、12 h，再分别给予生理盐水2 mL灌胃1次，CLP后24 h予麻醉并腹主动脉采血致死；治疗组于CLP后立即予通腑泻肺方中药灌胃1次，CLP后6 h、12 h，再分别给予通腑泻肺方中药灌胃1次，CLP后24 h予麻醉并腹主动脉采血致死。观察各组大鼠的一般表现，ELISA法检测各组血清中Caspase-1含量，Western blot法检测各组大鼠肺组织中NLRP3、ASC含量，RT-PCR法检测肺组织中NLRP3、ASC的mRNA表达量。结果模型组和治疗组肺组织NLRP3、ASC的蛋白水平、mRNA表达水平以及血清中caspase-1水平均显著高于空白对照组和假手术组（P＜0.01）；模型组肺组织NLRP3、ASC的蛋白水平、mRNA表达水平以及血清中Caspase-1水平显著高于治疗组（P＜0.01）。结论通腑泻肺方能够下调脓毒症急性肺损伤大鼠NLRP3、ASC、Caspase-1的表达水平，具有调控NLRP3炎性体合成的作用。

脓毒症 通腑泻肺方 炎性体 急性肺损伤

脓毒症是由感染引发的全身炎症反应综合征（SIRS），是烧创伤、休克等临床危急重症严重并发症之一，也是诱发脓毒性休克、多器官功能障碍综合征（MODS）的重要原因。脓毒症的发病率呈逐年上升的趋势，其病死率也居高不下。防治脓毒症措施的研究是目前临床亟待解决的重要课题。本文作者之一熊旭东教授通过长期临床观察、总结近现代中医各家对脓毒症病因病机的认识，根据中医藏象学说中“肺与大肠相表里”理论，提出以肺肠同治法治疗肺炎脓毒症和脓毒症急性肺损伤，并自拟中药通腑泻肺方应用于临床，取得较好的疗效。本实验拟通过观察通腑泻肺方对脓毒症急性肺损伤大鼠NLRP3炎性体、半胱天冬氨酸酶-1（Caspase-1）表达的影响，探索通腑泻肺方治疗脓毒症急性肺损伤的作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及模型制备 清洁级8周龄健康成年雄性SD大鼠32只，体质量200～220 g，购自上海中医药大学实验动物中心。采用盲肠结扎穿孔法（CLP）造模。大鼠经2％的戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后，于腹正中线做一1.5 cm纵行切口，找到盲肠，在其根部用缝合线结扎，用18号针将盲肠穿通3次，并挤出少量肠内容物，留置2 mm皮瓣防止针孔闭合，将盲肠还纳腹腔，逐层缝合腹壁切口，术毕予皮下注射生理盐水（30 mL/kg）抗休克。

1.2 器材与试剂 大鼠Caspase-1定量酶联检测试剂盒，购自上海森雄科技实业有限公司；总RNA提取试剂盒Ⅱ，由广州捷倍斯生物科技有限公司生产。逆转录采用Fermentas公司的RevertAid First Strand cDNA合成试剂盒。PCR反应采用康为世纪的UltraSYBR Mixture试剂盒。

1.3 通腑泻肺方的制备 通腑泻肺方药物组成：生大黄3 g，葶苈子15 g，川芎9 g，黄芩15 g。加10倍体积的蒸馏水将饮片浸泡30 min后大火煮沸，沸腾后继续煎煮20 min，起锅前10 min加入大黄，第2煎加6倍体积的蒸馏水煎煮，沸腾后继续煎煮20 min。2次煎液混合，用4层无菌纱布过滤，药液浓缩成含生药1.0 g/mL，置4℃冰箱保存备用。

1.4 动物分组及干预措施 清洁级8周龄健康成年雄性SD大鼠32只，随机分为4组：空白对照组8只，假手术组8只，模型组8只，治疗组8只。空白对照组不做任何处理，24 h后麻醉并腹主动脉采血致死。假手术组麻醉后开腹，翻动胃肠后关腹，24 h后麻醉并腹主动脉采血致死。模型组于CLP后立即予生理盐水2 mL灌胃1次，CLP后6 h、12 h，再分别给予生理盐水2 mL灌胃1次，CLP后24 h予麻醉并腹主动脉采血致死。治疗组于CLP后立即予通腑泻肺方中药（10 g/kg）灌胃1次，CLP后6 h、12 h，再分别给予通腑泻肺方中药（10 g/kg）灌胃1次，CLP后24 h予麻醉并腹主动脉采血致死。

1.5 标本采集 2％戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，打开腹腔，拉开肠等腹腔内器官，打开后腹膜，暴露腹主动脉，以10 mL无菌注射器缓慢抽血，分装在非抗凝无菌试管中，静置30 min，以3000 r/min离心15 min，取上层血清200 μL，分装入EP管中，-20℃冰箱保持待用。大鼠采血后取肺组织标本用锡纸包好后置入液氮罐中保存待用。

1.6 检测指标及方法 观察术后24 h内大鼠的一般状况，包括精神状态、食欲、活动情况、外观形态、毛色、粪便、分泌物等。ELISA法检测大鼠血清Caspase-1含量；Western-Blot法检测肺组织NLRP3、ASC蛋白含量；荧光定量PCR法检测肺组织NLRP3、ASC的mRNA表达水平。NLRP3引物序列如下。上游：5′-GCTA AGAAGGACCAGCCAGA-3′。下游：5′-CCAGCAAACC TATCCACTCC-3′。扩增长度：100bp。ASC引物序列如下。上游：5′-TTGCTGGATGCTCTGTATGG-3′。下游：5′-CCAAGTAGGGCTGTGTTTGC-3′。扩增长度：172 bp。GAPDH引物序列如下。上游：5′-ACCACAGTCCATGC CAT-CAC-3′。下游：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。扩增长度：452 bp。

1.7 统计学处理 应用SPSS 21.0统计软件。符合正态分布，计量资料以（±s）表示，正态性检验的检验水准α＝0.10，方差分析的检验水准α＝0.05。两组之间比较用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组一般状况比较 空白对照组和假手术组大鼠外观形态、饮食、活动等情况正常。模型组大鼠术后出现精神萎靡，活动明显减少，呼吸频率明显加快，饮食明显减少，腹部出现膨隆，眼角出现分泌物，排泄物增多等状况。治疗组大鼠上述症状较模型组为轻，精神状态、活动情况明显好于模型组，腹部膨隆、分泌物、排泄等情况也优于模型组。

表1 各组大鼠血清Caspase-1水平的比较（±s）

表1 各组大鼠血清Caspase-1水平的比较（±s）

与空白对照组比较，*P＜0.01；与假手术组比较，＃P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.01。下同。

组 别 n Caspase-1空白对照组 8假手术组 8模型组 8 13.30±2.68 12.56±3.60 49.16±6.70*#治疗组 826.46±1.88*#△

2.2 各组大鼠血清Caspase-1水平的比较 见表1。模型组和治疗组的Caspase-1水平显著高于空白对照组和假手术组，模型组Caspase-1水平显著高于治疗组（P＜0.05或P＜0.01），空白对照组和假手术组水平相当（P＞0.05）。

2.3 各组大鼠肺组织NLRP3、ASC蛋白水平的比较见表2。模型组和治疗组的NLRP3、ASC蛋白水平显著高于空白对照组和假手术组，模型组NLRP3、ASC蛋白水平显著高于治疗组（P＜0.05或P＜0.01），空白对照组和假手术组水平相当（P＞0.05）。

表2 各组大鼠肺组织NLRP3、ASC蛋白水平比较（±s）

表2 各组大鼠肺组织NLRP3、ASC蛋白水平比较（±s）

组 别 n NLRP3/GAPDH ASC/GAPDH空白对照组 8 0.44±0.01 0.40±0.04假手术组 8 0.48±0.03 0.42±0.02模型组 8 1.47±0.06*# 1.17±0.05*#治疗组 8 0.90±0.05*#△ 0.78±0.03*#△

2.4 各组大鼠肺组织NLRP3、ASC的mRNA表达水平的比较 见表3。模型组和治疗组的NLRP3、ASC的mRNA表达水平显著高于空白对照组和假手术组，模型组NLRP3、ASC的mRNA表达水平显著高于治疗组（P＜0.05或P＜0.01），空白对照组和假手术组水平相当（P＞0.05）。

表3 各组大鼠肺组织NLRP3、ASC的mRNA表达水平比较（±s）

表3 各组大鼠肺组织NLRP3、ASC的mRNA表达水平比较（±s）

组 别 n NLRP3 mRNA相对表达量 ASC mRNA相对表达量空白对照组 8 1.49±0.31 0.17±0.03假手术组 8 1.74±0.16 0.20±0.06模型组 8 117.17±6.64*# 1.78±0.10*#治疗组 8 72.67±4.30*#△ 0.98±0.06*#△

3 讨论

通腑泻肺方以生大黄为君，以其苦寒之性，通腑泻热，釜底抽薪。葶苈子苦降辛散，性寒清热，泻肺中水饮及痰火而平喘；黄芩上行泻肺火，下行泻膀胱之火，清热解毒、宣肺化痰；两药共为臣药。佐以川芎有行气活血，调畅气机之功效。之前的研究显示通腑泻肺方可以降低AECOPD患者白介素8（IL-8）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的水平［1］，本实验则从炎性体的角度，探讨通腑泻肺方对脓毒症急性肺损伤的作用机制。

炎性体（inflammasome）是存在于细胞胞浆内的一类由活化的核苷酸结合寡聚化结构域样受体（NLRs）诱导装配而成的大分子、多蛋白复合物［2］，具有介导机体固有免疫反应的重要作用。NLRP3炎性体是炎性体家族中的一员，其结构是由NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、半胱天冬氨酸酶-1前体（pro-caspase-1）装配组成的。NLRP3通过识别病原相关分子模式（PAMPs）或危险相关分子模式（DAMPs），与配体结合而被激活，诱导NLRP3炎性体组装，并促使其发生寡聚化，寡聚化的pro-caspase-1则发生自身酶解，形成具有生物活性的caspase-1，caspase-1促使白介素-1β前体（pro-IL-1β）和白介素-18前体（pro-IL-18）成熟，生成具有生物活性的IL-1β和IL-18，并分泌到细胞外，从而发挥其生物效应。NLRP3炎性体可以被广泛的外源性和内源性的刺激物所激活。微生物感染，如仙台病毒、流感病毒、腺病毒、酿酒酵母菌和白色念珠菌，以及一些细菌如金黄色葡萄球菌，单核细胞增生李斯特菌，福氏志贺菌等［3-5］均可以诱导NLRP3炎性体的激活。在某些情况下，一些特定的微生物成分也可以触发NLRP3炎性体的激活，如细菌RNA，疟原虫色素结晶［6-7］和许多细菌成孔毒素，如尼日利亚菌素、刺尾鱼毒素、气单胞菌溶素和李斯特菌溶胞素［5］等。

炎性体作为固有免疫应答过程中的重要物质，与脓毒症的发生发展具有密切的联系。炎性体主要通过激活caspase-1从而起到抗感染、清除病原微生物的重要作用。有研究显示，将小鼠的caspase-1基因敲除后，其对包括大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、土拉热杆菌、福氏志贺菌等在内的多种革兰氏阴性菌呈现出明显的易感性，抵御李斯特假单胞菌和白色念珠菌的能力也明显降低［8］。与野生型杂合子小鼠相比，caspase-1基因敲除小鼠的抗感染能力明显下降，在脓毒症中的死亡率明显升高［9］。

在本实验中模型组和治疗组的NLRP3、ASC蛋白水平和mRNA表达水平均显著高于空白对照组和假手术组，说明NLRP3炎性体水平在脓毒症发病时出现明显升高，提示其在脓毒症的病理机制中具有重要作用。治疗组的NLRP3、ASC蛋白水平和mRNA表达水平也明显较模型组低，说明通腑泻肺方能够使NLRP3、ASC的表达下调，从而调控NLRP3炎性体的合成。模型组和治疗组的caspase-1水平显著高于空白对照组和假手术组，而治疗组caspase-1水平显著低于模型组。这一结果说明通腑泻肺方具有下调Caspase-1水平的作用，这与其对NLRP3、ASC的调控作用是相一致的。同时，本实验结果也提示通过调控炎性体而调节炎性反应的程度可能成为脓毒症治疗的靶点。

［1］陈莉云，熊旭东，李淑芳.通腑泻肺方对AECOPD痰热壅肺证的疗效分析及对炎症介质的影响［J］.中国中医急症，2013，22（9）：1512-1514.

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Experimental Study of Tongfuxiefei Decoction on Regulating NLRP3 in Rats with Sepsis in Acute Lung Injury

ZHANG Tao，XIONG Xudong，ZHAO Min. Shu Guang Hospital Affiliated to Shanghai University of TCM，Shanghai 200021，China

Objectives：To observe the effect of Tongfuxiefei decoction on expression of inflammasome NLRP3 in rats with sepsis in acute lung injury（ALI）and to explore the mechanism of Tongfuxiefei decoction in sepsis treatment.Methods：The animal model of sepsis in acute lung injury was made by cecal ligation and puncture（CLP）. 32 male SD rats were randomly divided into four groups：control group，sham operation group，model group and treatment group.Each group has 8 rats.The control group rats were sacrificed by extracting the blood from abdominal aorta after anesthesia.The sham operation group rats were opened the abdomen and turned over intestinal tract after anesthesia，then closed the abdomen，got the blood 24 h later after anesthesia.The model group rats were given 2ml normal saline and the treatment group rats were given Tongfuxiefei decoction by intragastric administration 6 h and 12 h after CLP.Rats in both groups were sacrificed by extracting the blood from abdominal aorta at 24h later after CLP.Observe the general performance of each group.Enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect the level of Caspase-1 in serum.The protein and the mRNA expressions of NLRP3 and ASC in lung tissue were respectively detected by Western blot method and reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）.Results：The protein levels and mRNA expressions of NLRP3 and ASC，and Caspase-1 levels of the model group and of the treatment group were significantly higher than those of the control group and of the sham operation group（P＜0.01）.The protein levels and mRNA expressions of NLRP3 and ASC，and Caspase-1 levels of model group were significantly higher than those of treatment group（P＜0.01）.Conclusions：Tongfuxiefei decoction can reduce the expression of NLRP3 and ASC as well as the level of Caspase-1，so as to regulate NLRP3 synthesis.

Sepsis；Tongfuxiefei decoction；Inflammasome；Acute lung injury

R285.5

A

1004-745X（2014）08-1406-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.08.004

2014-05-11）

高等学校博士学科点专项科研基金（20113107110003）

△通信作者