辅助降血糖类保健食品非法添加化学物质检测方法研究

吴杨 张圆 闵春艳 郝刚 顾炳仁

（苏州市食品药品检验所，江苏 苏州 215104）

辅助降血糖类保健食品非法添加化学物质检测方法研究

吴杨 张圆 闵春艳 郝刚 顾炳仁

（苏州市食品药品检验所，江苏 苏州 215104）

目的：利用超高效液相-串联四级杆-飞行时间液质联用系统（UPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS），建立快速可靠灵敏的测定辅助降血糖类保健食品中非法添加二甲双胍、丁二胍、苯乙双胍、甲苯磺丁脲、格列齐特、吡格列酮、罗格列酮、格列波脲、格列吡嗪、瑞格列奈、格列美脲、格列本脲和格列喹酮13种化学药品的液质联用检测方法。方法：采用UPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS检测，以Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18为填充柱；0.1%甲酸-0.01 mol/L乙酸铵水溶液和甲醇梯度洗脱，流速0.3 mL/min；ESI正离子模式，一级、二级质谱全扫描，进行UPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS的定性及定量分析。结果：此方法经过验证，线性良好（r＞0.99）、精密度RSD＜3%、样品回收率在74.1%～ 90.0%之间，检出限在9.29～ 60.0 ng/mL之间，均能满足辅助降血糖类保健食品非法添加化学成分筛查的要求。结论：此方法快速、准确、灵敏度高、分离度高，可为辅助降血糖类保健食品非法添加筛查检测提供有力工具。

超高效液相-串联四级杆-飞行时间液质联用系统；辅助降血糖；保健食品；非法添加化学物质

随着生活水平的提高，人们越来越关注自身的健康状况，对保健食品的需求逐年增加，但在保健食品中非法添加化学成分的现象目前相当严重，严重损害了消费者的身心健康和经济利益，产生的不良反应甚至危及百姓生命。

目前市场上声称辅助降血糖类的保健食品常见的添加化学物质主要有：双胍类降糖药；磺酰脲类降糖药（如甲苯磺丁脲及格列奈类）；噻唑烷二酮类降糖药（如罗格列酮、吡格列酮）等。这些保健食品长期使用会造成病人出现较强的副作用，甚至有死亡的危险。

目前国家食品药品监督管理总局药品检验补充检验方法和检验项目批准件共有 3个文件（批准件编号2009029，2011008，2013001）对降血糖类保健食品和中成药进行非法添加化学药品的筛查和验证，包括 13种化学药品，共需用 3个液相系统方法，耗时且繁琐。已有文献报道[1-5]，筛查的降血糖类化学药物较少，未能全部覆盖目前3个系统的全部降血糖类对照品。本实验拟建立快速、高效、准确筛查降血糖类保健食品非法添加化学物质的方法，在同一系统中完成13种药物的筛查。利用超高效液相色谱-串联四级杆-飞行时间液质联用系统（UPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS），建立快速可靠灵敏的测定辅助降血糖类保健食品中违法添加二甲双胍、丁二胍、苯乙双胍、甲苯磺丁脲、格列齐特、吡格列酮、罗格列酮、格列波脲、格列吡嗪、瑞格列奈、格列美脲、格列本脲、格列喹酮13种化学药品的液质联用检测方法，覆盖现行标准的所有非法添加物质。

1 仪器与试药

1.1 仪器

美国安捷伦公司 1290 Infinity-6538-Q-TOF超高效液相色谱-串联四级杆-飞行时间液质联用仪；ML204电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ5200超声波清洗器（昆山超声波仪器有限公司）；Millipore公司Milli-Q纯水仪。

Q-TOF定性软件：Mass Hunter Workstation Software Qualitative Analysis Version B.05.00 Build 5.0.519.13。

PCDL软件：Mass Hunter PCDL Manager Version B.04.00 Build 92.0。

1.2 试剂信息

甲醇，MERCK公司，LC-MS级；甲酸，MERCK公司，LC-MS级；乙酸铵，SIGMA-ALDRICH公司，LC-MS级；水为Milli-Q纯水仪制去离子水。

1.3 对照品信息

13 种对照品二甲双胍、丁二胍、苯乙双胍、甲苯磺丁脲、格列齐特、吡格列酮、罗格列酮、格列波脲、格列吡嗪、瑞格列奈、格列美脲、格列本脲、格列喹酮均来自中国食品药品检定研究院，纯度均大于99%。

1.4 样品信息

7批样品均来自于各级食品药品监督管理局市场抽样。

2 实验步骤

2.1 色谱条件

Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱，Rapid Resolution HD，2.1×100 mm，1.8-Micron填料粒径；DAD（二极管阵列）检测器，检测波长230 nm；扫描波长范围190～ 400 nm，步长（step）：2 nm。流动相：A（0.1%甲酸-10 mmol乙酸铵水溶液）、B（甲醇），流速：0.3 mL/min；柱温：30℃。进样体积：1 μL。洗脱梯度：时间 （min）/B%∶0 min 10%，5 min 55%，13 min 95%，15 min 95%，后运行时间（post runtime）∶2 min。13种宣称辅助降血糖类非法添加成分的一级提取离子流色谱叠加图见图1。

图1 13种宣称辅助降血糖类非法添加成分一级提取离子流色谱叠加图

2.2 质谱条件

电喷雾离子化源（ESI）；毛细管温度 350℃；干燥气流量 10 L/min；雾化气压力 40 psi；喷雾电压 3 500 V；破碎电压（fragmentor）135 V；正离子检测方式；扫描方式为一级、二级质谱全扫描。二级碎片碰撞能量见表1。

表1 13种辅助降血糖类保健食品非法添加成分相关色谱、质谱信息

2.3 对照品溶液的制备

取二甲双胍、丁二胍、苯乙双胍、甲苯磺丁脲、格列齐特、吡格列酮、罗格列酮、格列波脲、格列吡嗪、瑞格列奈、格列美脲、格列本脲和格列喹酮对照品各约5 mg，精密称定，分别置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为单标储备液。再分别取各单标储备液1 mL置同一50 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，配成含上述各对照品10 μg/mL的混合标样，供进样分析。

2.4 供试品溶液的制备

若供试品为固体制剂，精密称取一次服用量，研细后转移至10 mL量瓶中，加甲醇约8 mL，超声处理15分钟，冷却至室温，用甲醇稀释至刻度，摇匀，静置，取适量上清液至2 mL离心管，离心5分钟，取上清液100 μL并用甲醇稀释至1 mL，即得。

若供试品为液体制剂，精密量取一次服用量，置10 mL量瓶中，加甲醇适量，超声处理15分钟，冷却至室温，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过。量取续滤液适量于2 mL离心管中，离心5分钟，取上清液100 μL并用甲醇稀释至1 mL，即得。

2.5 标准谱库的建立

将13种宣称辅助降血糖类保健食品非法添加成分的名称、分子式、精确相对分子质量以及通过实验对 13种对照品测得的保留时间、碰撞能量、二级图谱等信息导入 PDCL Manager（美国Agilent公司）软件，建立13种非法添加成分标准谱库，便于检索和筛查。

3 方法学验证

按照上述实验步骤，对方法的专属性、线性范围和检出限、精密度、准确度进行全面考察，结果均符合要求。13种辅助降血糖类保健食品非法添加成分相关色谱、质谱信息见表1。

3.1 检出限

取13种对照品混标溶液，分别稀释进样，按信噪比S/N=3.0计算各化合物的检出限。13种降血糖类药物的检出限见表2。

3.2 标准曲线

取 13种对照品混标溶液，分别稀释，配制成含13种降血糖类药物各 0.1，0.2，0.5，1，2，5，10，20 μg/mL的标准曲线工作溶液。13种降血糖类药物的线性方程和相关系数见表2。根据拟合方程可知，r＞ 0.99，说明瑞格列奈在0.1～ 10 μg/mL范围内线性良好，另12种降血糖类药物在0.2～20 μg/mL范围内线性良好。

表2 13种降血糖类药物的线性方程、相关系数、检出限

3.3 精密度

取 2 μg/mL的混标连续进样 6次，按峰面积计算每种化合物RSD。样品精密度测定结果见表2。由表可知，此实验条件的精密度＜3%，说明仪器精密度良好。

3.4 加样回收率

取阴性样品5份，平行添加10 μg/mL的混合对照品溶液，按“2.4”项下处理，测定，计算回收率及相对标准偏差（RSD，n=6）加样回收率在74.1%～90.0%之间，RSD在0.5% ～ 7.1%之间，具体见表2。说明该处理样品的方法提取效率较高，方法准确度较好。

4 样品测定及结果

采用“2.4”项下处理并分析7批样品，设置提取质量窗口为精确相对分子质量 ＜ 20 ppm，保留时间漂移＜0.1 min，根据保留时间、母离子、碎片离子、紫外光谱等信息综合判断，确定检出化合物。结果表明，在7批样品中，有1批检出格列本脲，含量为735.0 μg/g。

5 讨论

5.1 梯度洗脱条件的建立

由于磺酰脲类降血糖药（如甲苯磺丁脲、格列本脲、格列吡嗪、格列美脲、格列齐特、格列喹酮、瑞格列奈）、双胍类降血糖药（如二甲双胍、苯乙双胍）和噻唑烷二酮类降血糖药（如罗格列酮、吡格列酮）极性差异较大，故优化梯度洗脱条件，将三类降血糖药合并在同一个液相系统中，13个对照品可实现基本分离，峰形良好，专属性强。

5.2 PCDL谱库的规范建立

将13种降血糖类非法添加化学成分的名称、分子式、精确相对分子质量以及通过实验对13种对照品测得的保留时间、二级图谱等信息导入PCDL manager软件，形成谱库，为以后的降血糖非法添加送检保健食品的快速检测提供了便利。

[1] 黄湘鹭，王静文，曹进，等.降血糖类保健食品中非法添加的8种药物检测及实例分析[J].食品科学，2014，35（10）：149-152.

[2] 罗疆南，曹玲，谭力，等.HPLC-MS/MS检测中药及保健品中添加的11种降糖类化学药物[J].中国药学杂志，2010，45（11）：68-70.

[3] 朱峰，阮丽萍，马永建，等.超高效液相色谱－串联质谱联用法同时检测降糖类和减肥类保健品中20种非法添加的化学降糖药物[J].色谱，2014，32（1）：13-20.

[4] 肖树雄，李杨杰.由降糖中成药和保健食品检验情况探索非法添加化学成分的系统快筛思路[J].药物分析杂志，2011，31（2）：418-422.

[5] 魏清芳，王嘉林.液相色谱 -串联四极杆质谱测定中药及保健品中非法添加 8种化学降糖药[J].中国药事，2011，25（1）：70-72.

Study on the Detection Method for Illegally Added Chemicals in Auxiliary Hypoglycemic Health Food

Wu Yang，Zhang Yuan，Min Chunyan，Hao Gang，Gu Bingren
（Suzhou Institute For Food and Drug Control，Jiangsu Suzhou 215000，China）

Objective：To establish a fast，accurate and sensitive method for the detection of illegally added chemicals in auxiliary hypoglycemic health food by UPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS.The chemicals include metformin，buformin，phenformin，tolbutamide，gliclazide，pioglitazone，rosiglitazone，glibornuride，glipizide，repaglinide，glimepiride，glyburide and gliquidone.Methods：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18analysis column was adopted with a mobile phase of 0.01 mol/L ammonium acetate （containing 0.1%acetic acid）-methanol using gradient elution，and the flow rate was 0.3 mL/min.ESI＋scan and MS/MS mode were taken.Qualitative and quantitative analysis were carried out by UPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS.Results：The method was validated，a linear range was good（r＞0.99）with a precision of RSD ＜3%，the recovery was between 74.1% ～ 90.0%and the limit of detection was between 9.29 ～ 60.0 ng/mL，which can fully meet the screening requirements.Conclusion：This method is fast and accurate with a high sensitivity and a high degree of separation.It can be used for the screening and detection of illegally added chemicals in auxiliary hypoglycemic health food.

UPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS；Auxiliary Hypoglycemic；Health Food；Illegally Added Chemicals

10.3969/j.issn.1672-5433.2014.10.003

2014-08-19）

苏州市科学技术局科学计划项目（SS201220）

吴杨，男，主管药师。研究方向：药物分析。E-mail：973919367@qq.com

顾炳仁，男，硕士生导师，主任药师。研究方向：药物分析与管理。通讯作者E-mail：2803307338@qq.com