苯酚-硫酸法测定益肺通络颗粒水提液总多糖含量

谭喜平，夏新华*，罗纯清，黄 莉, 颜 红，曾建国，刘艳科

(1.湖南中医药大学 药学院，湖南 长沙 410208；2.长沙市中心医院，湖南 长沙 410004)



苯酚-硫酸法测定益肺通络颗粒水提液总多糖含量

谭喜平1，夏新华1*，罗纯清1，黄 莉1, 颜 红1，曾建国2，刘艳科2

(1.湖南中医药大学 药学院，湖南 长沙 410208；2.长沙市中心医院，湖南 长沙 410004)

目的：建立益肺通络颗粒水提液总多糖的含量测定方法。方法：以葡萄糖为对照品，通过单因素试验，优选苯酚-硫酸法测定总多糖的最佳显色条件。结果：最佳显色条件为：加 5%苯酚1.0mL,浓硫酸6.0mL,在100℃的条件下反应20min，冰水中冷却至室温。葡萄糖质量在16.6～124μg范围内与吸光度呈良好线性关系(r=0.999 1)，平均回收率为100.6%,RSD为2.5%。结论：该法快速准确、稳定方便，可用于益肺通络颗粒工艺研究中总多糖的含量测定。

益肺通络颗粒；苯酚-硫酸法；总多糖；含量测定

多糖是由糖苷键结合、超过10个以上的单糖组成的聚合糖高分子碳水化合物，在自然界分布极广，具有增强机体免疫功能、抗菌、抗肝炎等方面的作用[1-2]。益肺通络颗粒是国家“十一五”科技重大专项中医药治疗肺结核临床科研基地建设中的自拟处方，由黄精、白及等11味药组成，常与抗结核西药联合治疗肺结核，具有益气养阴、化瘀通络、去腐生肌之功效，其中黄精、白及为处方中的君药，主要活性成分为黄精多糖、白及多糖，具有抗菌、增强机体免疫功能作用[3-4]，为处方中的主要活性成分。本研究拟采用苯酚-硫酸法建立该处方总多糖的含量测定方法[5-7]，以加强该制剂的工艺研究与质量控制，为进一步深入研究奠定基础。

目前，多糖的含量测定方法主要有比色法、滴定法、色谱法、毛细管电泳法(HPCE)等[1，8]。滴定法受温度和滴定速度的影响较大，且不能排除还原糖的干扰；色谱法(主要有薄层扫描法、HPLC法、GC法)虽然简便、快捷、准确，但需多糖标准品和特定酶，应用受限制[9]；HPCE主要用于蛋白质、多肽等大分子物质的分析，在糖分析中的应用较少；而比色法(应用最为广泛的有苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法)虽干扰因素多、重现性较差，但操作简单，易于快速测定，两种方法对比，以苯酚-硫酸法较为稳定，为多糖较为理想的含量测定方法[10]。本研究通过采用单因素试验，对苯酚-硫酸法显色条件进行优化，为该处方中多糖的含量测定方法的建立提供实验依据。

1 材料、试剂与仪器

1.1 材料与试剂

黄精、白及等11味药材(均购自湖南省三湘中药饮片有限公司)；D-无水葡萄糖(批号：110833-201205，供含量测定用，含量以 99.5%计，由中国食品药品检定研究院提供)；无水乙醇(湖南汇虹试剂有限公司)。

1.2 仪器与设备

UV1102紫外分光光度计(上海天美科学仪器有限公司)；电子分析天平(AY120，Shimadzu 0.1mg～120g)，80-1型电动离心机(城西晓阴电子仪器厂)，旋转蒸发器RE-52(上海亚荣生化仪器厂)；98-1C型数字控温电热套(天津市斯特仪器有限公司)，SHZ-Ⅲ型循环水真空泵(上海亚荣生化仪器厂)；10mL具塞刻度试管。

2 方法与结果

2.1 复方水提液制备

称取黄精、白及等11味药(一个处方量165g)，加热回流提取2次，第1次加10倍量水，回流提取2h；第2次加8倍量水，回流提取1.5h，过滤，合并2次提取的药液，减压浓缩，定容至1 000mL，备用。

2.2 含测用溶液制备

2.2.1 对照品溶液制备 精密称取置105 ℃条件下干燥恒重的葡萄糖对照品0.082 9g，加水制成葡萄糖含量为0.082 9mg/mL的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液制备 精密移取供试品药液2mL置离心管中，加无水乙醇8mL，摇匀，3 000r/s 离心15min，弃去上清液，沉淀物加80%的乙醇洗涤2次，8mL/次(每次离心10min)，挥干乙醇后，沉淀加蒸馏水溶解，定容至100mL，精密量取上述稀释液10mL，加蒸馏水定容至25mL，即得。

2.2.3 不同浓度苯酚溶液制备 分别精密量取苯酚2、3、4、5、6、7g，置100mL容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，即得。

2.3 总多糖含量测定

2.3.1 显色条件确立

(1)检测波长确定。精密吸取对照品溶液0.8mL,供试品溶液2mL，置有刻度的具塞试管中，加水定容至2mL，加5%苯酚溶液1.0mL，摇匀，加入浓硫酸5.0mL(移液管垂直悬于试管口，快速加入)，摇匀，沸水中反应20min，取出，迅速置冰水中冷却至室温。以相应的试剂作空白对照，在波长400～800nm范围内进行扫描。结果显示，对照品在489.6nm处有最大吸收，供试品在488.6nm处有最大吸收，空白对照在此无吸收，故本试验选择489nm作为测定波长,见图1。

图1 葡萄糖对照品溶液(A)与供试品溶液(B)可见吸收光谱

(2)显色剂苯酚不同浓度考察。精密吸取对照品溶液1.0mL、供试品溶液2mL置于有刻度的具塞试管中，分别加入2%、3%、4%、5%、6%、7%的苯酚溶液1.0mL，摇匀，迅速加入浓硫酸5.0mL，摇匀，置于沸水浴中20min，取出，迅速至冰水中放至室温，并加水定容至9mL。平行制备3份，以蒸馏水代替糖溶液，以同样的方法制备空白对照品，在489nm 处测定吸光度。结果显示，对照品溶液、供试品溶液的吸光度值均在苯酚的浓度为5%时最大(分别为：0.339±0.014、0.348±0.09)，故本试验选择浓度为5%的苯酚,见图2。

图2 5%苯酚用量考察

(3)显色剂硫酸用量考察。精密吸取对照品溶液1.0mL、供试品溶液2mL，同“苯酚浓度考察”中方法分别加入浓硫酸3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0mL显色，489nm处测定吸光度。结果显示：随着浓硫酸加入量的递增，供试品(最大值：0.489±0.014)与对照品(最大值：0.465±0.014)的吸光度也呈现递增趋势，故本研究选择浓硫酸的用量为6mL。见图3。

图3 浓硫酸加入量考察

(4)反应温度考察。精密吸取对照品溶液1.0mL、供试品溶液2mL，同苯酚浓度考察中方法，分别置于0、20、40、60、80、100℃不同温度条件下显色，在489nm处测定吸光度。结果显示，对照品在反应温度为100℃时有最大吸光值(0.471±0.012)，供试品在反应温度为80℃时有最大吸收值(0.487±0.015)，因供试品在反应温度为80℃、100℃时的吸光值相差甚小，故本试验选择100℃作为最佳反应温度，见图4。

图4 反应温度考察

(5)反应时间考察。精密吸取对照品溶液1.0mL、供试品溶液2mL，同“苯酚浓度考察”中方法，分别置沸水浴中反应10、15、20、25、30、35min，于489nm处测定吸光度，结果显示，反应时间为20min时，吸光度值均最大(分别为0.468±0.012，0.501±0.018)，故本试验选择20min作为最佳反应时间，见图5。

图5 反应时间考察

(6)冷却条件考察。精密吸取对照品溶液1.0mL、供试品溶液2mL，同“苯酚浓度考察”中方法显色，分别置于冰水、常温水中冷却至室温，以蒸馏水代替糖溶液以同样的方法制备空白对照，在489nm处测定吸光度，结果显示，冰水中冷却时，对照品吸光值(0.475±0.014)、供试品吸光值(0.495±0.019)均优于常温水冷却，故本试验选择在冰水中迅速冷却的方法，见图6。

图6 冷却条件考察

(7)最佳显色条件验证。精密吸取对照品溶液1.0mL，供试品溶液2mL，置有刻度的具塞试管中，加入5%苯酚溶液1.0mL，摇匀，迅速加入浓硫酸6.0mL，摇匀，置沸水浴中反应20min，取出，迅速至冰水中放冷至室温，分别平行制备3份，以蒸馏水代替糖溶液，以同样的方法制备空白对照，在489nm处测定吸光度，结果显示，在最佳显色条件下制备的溶液中，对照品溶液吸光度的平均值为(0.475±0.023)，供试品溶液吸光度的平均值为(0.496±0.016)。

2.3.2 方法学考察

(1)标准曲线及线性范围。分别精密量取0.0829mg/mL的对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5mL置于有刻度的具塞试管中，按“最佳显色条件验证”项条件显色，用蒸馏水以同样方法作空白参比，在489nm处测定吸光度(Abs)。结果显示葡萄糖在16.6～124μg范围内与吸光度呈良好线性关系，R2=0.9991，见图7。

图7 葡萄糖对照品标准曲线

(2)精密度考察。精密吸取对照品溶液1.0mL分别置编号为6支有刻度的具塞试管中，按“最佳显色条件验证”项下方法显色，在489nm处测定吸光度，代入回归方程中计算，所得RSD值为2.48%(n=6)，表明该仪器重现性良好。

(3)稳定性试验。精密量取同一供试品溶液2mL，按“最佳显色条件验证”项下的方法显色，在显色体系反应完全后，分别在0、10、20、30、45、60min时，于489nm处测定吸光度。结果RSD值为1.06%(n=6)，表明供试品在1h内吸光度基本不变，具有良好稳定性。

(4)重复性试验。精密量取供试药液2mL，按供试品制备方法，平行制备6份供试品溶液，分别从中精密量取2mL，按“最佳显色条件验证”项下方法显色，于489nm处测定吸光度，代入回归方程中计算，得2mL供试液总多糖的平均含量为89.361μg，RSD值为1.79%(n=6)，表明该供试品重复性良好。

(5)加样回收试验。精密量取同一供试品溶液1mL，加对照品溶液1mL，按“最佳显色条件验证”项下的方法显色，平行制备6份，于489nm处测定吸光度，计算加样回收率，结果如表1所示，加样回收率较高，符合含量测定要求。

表1 回收率试验结果

(6)样品含量测定。称取黄精、白及等11味药(一个处方量165g)，按“2.1”项下方法平行制备3份供试品药液。再分别精密量取3份供试品溶液2mL，按“最佳显色条件验证”项下方法显色，于489nm处分别测定吸光度，代入回归方程计算，结果益肺通络颗粒工艺研究中，一个处方量提取液总多糖的含量为(5.632±0.021)g。

3 讨论

本试验在优化苯酚-硫酸法显色条件过程中，将对照品溶液和供试品溶液在不同显色条件下的测定结果进行综合分析，使优选的显色条件更有说服力。苯酚-硫酸法是在碳水化合物中广泛应用的一种方法，是测定多糖的常用方法[11]。本研究选用80%乙醇除去样品中众多单糖、低聚糖等干扰成分,再用去离子水提取样品中所含的多糖类成分，然后采用苯酚-硫酸法测定益肺通络颗粒处方提取液的多糖含量，多糖在浓硫酸的作用下，水解成单糖，并迅速脱水生成糠醛生物，与苯酚缩合生成橙黄色化合物，在489nm条件下有特征吸收，一定范围内的葡萄糖浓度与其吸光度呈线性关系。该方法具有快速简便、稳定可靠等特点，可作为益肺通络颗粒工艺研究中总多糖含量测定的参考依据。

实验过程中发现，苯酚-硫酸法显色反应的操作繁多，试剂的添加、反应时间和温度的控制都会造成实验结果的误差，故在分析检验操作时应注意：①苯酚溶液应现配现用，且使用前应充分摇匀，将其中的大量微小气泡排除;②样品显色时，加入苯酚后应迅速摇匀；加入硫酸时，应将滴管悬于试管口，迅速加入，摇匀；冰水中冷却2～3min，应立即置紫外分光光度计下测量；③应严格按照实验室操作规范，选用准确度高的量器，减少误差，使测量结果更加可靠。

[1] 郑晓艳,林艺华.中药多糖的提取、分离纯化及其含量测定方法概括[J].福建分析测试,2013,22(4)：58-62.

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(责任编辑：宋勇刚)

Determination of Total Polysaccharides in Aqueous Extracts of Yifei Tongluo Granules by Phenol-Sulfuric Acid Method

Tan Xiping1,Xia Xinhua1*,Luo Chunqing1,Huang Li1,Zeng Jianguo2，Liu Yanke2

(1.School of Pharmacy，Hunan University of Chinese Medicine,Changsha 410208，China；2.Changsha Central Hospital, Changsha 410004, China)

Objective:To establish the content determination method of total polysaccharides in aqueous extracts of Yifei Tongluo Granules.Methods:With grape sugar as reference substance，the best coloration conditions of phenol-sulfuric acid method for assaying total polysaccharides were optimized by single factor test.Results:The best coloration conditions were as follows: adding 1.0mL of 5% phenol and 6.0mL of sulfuric acid，reacting at 100℃ for 20min, and then cooling to room temperature in ice water. The mass of glucose had a good linear relationship with absorbance at the range of 16.6μg～124μg(r=0.999 1)，and the average recovery was 100.6%，RSD 2.5%.Conclusion:The method is fast，accurate，stable and convenient，which can be available for determination for total polysaccharide in the precess studies of Yifei Tongluo Granules.

Yifei Tongluo Granules；Phenol-sulfuric Acid Method; Total Polysaccharides；Content Determination

2014-05-09

国家科技重大专项“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”子课题(2013ZX10005004-003-001)

谭喜平(1989-)，女，湖南中医药大学硕士研究生，研究方向为中药新制剂及制剂质量标准研究。

夏新华(1962-)，男，博士，湖南中医药大学教授，博士生导师，研究方向为中药新制剂、新剂型、新技术及制剂质量标准研究。E-mail：xiaxinhua001@163.com。

R284.2

A

1673-2197(2014)17-0024-03