苦荞红曲保健酒的抗氧化活性

黄丹丹，周海媚，李 谣，杜木英，2*

（1.西南大学 食品科学学院，重庆 400716；2.西南大学 食品科学学院国家食品科学与工程实验教学示范中心，重庆 400716）

苦荞营养价值极高，含有丰富的蛋白质、脂肪、维生素和矿物质等，更主要的是含有丰富的黄酮类和多酚类化合物，具有很好的抗氧化活性[1-9]。红曲霉的应用在我国有悠久的历史，长期以来被广泛应用于食品着色、酿酒及制醋上。红曲霉代谢产生的抑菌物质、酶类、Monacolin K和麦角固醇等多种生理活性物质，具有降低血清胆固醇、抑菌、防癌等保健功效[10-14]，而且红曲味甘、性温，可消食活血、健脾燥胃。

本研究利用前期实验结果，以苦荞和糯米为主要原料，经红曲、酵母发酵研制成苦荞红曲保健酒，为研究其抗氧化功能，测定了苦荞红曲保健酒中总黄酮、总酚的含量，研究了其体外抗氧化能力，并与普通市售黄酒、VC、水溶性维生素E（Trolox）进行对比，同时分析了总黄酮、总酚含量与抗氧化能力之间的相关性，以期为苦荞红曲保健酒的开发与深加工提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苦荞红曲保健酒：西南大学食品科学学院实验室自制；黄酒：市售绍兴会稽山五年陈酿黄酒；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（2,2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS）、2,4,6-三 吡 啶基三嗪（2,4,6-tripyridyl-triazine，TPTZ）、Trolox 均为分析纯：美国Sigma公司；芦丁标准品、没食子酸：中国药品生物制品检定所；福林酚：北京索莱宝科技有限公司；VC、浓盐酸、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、硫酸亚铁、三氯化铁、冰乙酸、乙酸钠、无水乙醇、过硫酸钾、碳酸钠均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

FA1004A型分析天平：上海精天电子仪器有限公司；HHS型电热恒温水浴锅：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；PHS-3C型pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；UV-1240型紫外分光光度计：日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 苦荞红曲保健酒的制备

苦荞和糯米原料配比为1∶1.5，糯米蒸熟摊凉后与苦荞混匀，按质量分数添加0.6%甜酒曲，于28 ℃糖化2 d后，再添加1‰酵母和12%的红曲，于28 ℃发酵6 d。经压榨、煎酒后即得苦荞红曲保健酒。

1.3.2 总黄酮的测定[15]

（1）样品的制备[16]

移取10 mL混合均匀的样液到100 mL烧杯中，以0.1 mol/L NaOH调pH值至中性，再多加2滴，移入100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，备用。

（2）芦丁标准曲线的绘制

准确称取在105 ℃干燥至质量恒定的芦丁20 mg置于100 mL容量瓶中，用体积分数30%乙醇定容至刻度，摇匀。即得芦丁质量浓度0.2 mg/mL的标准品溶液。分别取上述芦丁标准溶液0、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL于10 mL具塞比色管中，加入0.3 mL 5%亚硝酸钠溶液，静置6 min，加入0.3 mL 10%硝酸铝溶液，静置6 min，加入2 mL 4%氢氧化钠溶液，混匀后，加入体积分数30%乙醇至刻度，放置15 min后于510 nm波长处测吸光度值。以吸光度值为纵坐标，芦丁质量浓度为横坐标绘制芦丁标准曲线，得到线性回归方程：y=10.611x+0.003 1（R2=0.999 8）。

（3）样液测定

取2 mL样液2等份，分别置于10 mL具塞比色管中，加入0.3 mL 5%亚硝酸钠溶液，静置6 min，加入0.3 mL 10%硝酸铝溶液，静置6 min，加入2 mL 4%氢氧化钠溶液，混匀后，加入体积分数30%乙醇至刻度，放置15 min后于510 nm波长处测吸光度值（以不加硝酸铝作为空白）。

1.3.3 总酚的测定[17]

（1）没食子酸标准曲线的绘制：称取0.500 g没食子酸用水定容于100 mL容量瓶中，制得5 mg/mL的标准酚溶液，分别吸取0、0.3 mL、0.6 mL、0.9 mL、1.2 mL、1.5 mL标准酚溶液于100 mL容量瓶中，用水定容，则酚质量浓度依次为0 μg/mL、15 μg/mL、30 μg/mL、45 μg/mL、60 μg/mL、75 μg/mL。分别从其中吸取1 mL标准溶液，加4 mL水补至5 mL，再加入0.5 mL福林酚，充分摇匀30 s后，加入1 mL 7.5%碳酸钠溶液，45 ℃条件下反应15 min后，在765 nm波长处测吸光度值，以没食子酸质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制没食子酸标准曲线，得到线性回归方程：y=0.079 6x+0.007 8（R2=0.999 0）。

（2）样液测定：实验组加样液0.05 mL、4.95 mL去离子水，空白组为5 mL水，向各管中加入0.5 mL福林酚，充分摇匀，30 s后加入1 mL 7.5%碳酸钠溶液，45 ℃反应15 min，在765 nm波长处测吸光度值。

1.3.4 抗氧化活性的测定

（1）DPPH自由基清除率的测定[18]：称取0.007 9 g DPPH标准品，用无水乙醇溶解后定容至100 mL容量瓶中，配制得0.2 mmol/L DPPH溶液，同时配制不同浓度梯度的样液（无水乙醇稀释）。吸取0.1 mL样品溶液，加入3.9 mL DPPH溶液，暗处避光30 min后于517 nm波长处测吸光度值A1，用无水乙醇作参比。同时测定0.1 mL 无水乙醇与3.9 mL DPPH溶液混合后的吸光度值A2，以及0.1 mL样品溶液与3.9 mL无水乙醇混合后的吸光度值A3，按以下公式计算DPPH自由基清除率，同时用绍兴黄酒、0.4 mg/mL VC和0.8 mg/mL Trolox作对比。

（2）ABTS自由基清除率的测定[19]：将等量的7 mmol/L ABTS溶液与2.45 mmol/L过硫酸钾水溶液混合避光放置12～16 h。用无水乙醇将该溶液稀释至其在波长为734 nm处吸光度为0.7±0.02，得到ABTS自由基工作液（现配现用），同时制备不同浓度梯度的样液（乙醇稀释）。吸取0.15 mL样品溶液，加入2.85 mL ABTS自由基工作液，暗处避光10 min后734 nm波长处测定吸光度值A1，以无水乙醇为参比。同时测定0.15 mL无水乙醇与2.85 mL ABTS自由基工作液混合后的吸光度值A2，ABTS自由基清除率计算公式如下，同时用绍兴黄酒、0.4mg/mL VC和0.8 mg/mL Trolox作对比。

（3）FRAP值的测定[20]：将300 mmol/L 醋酸钠缓冲溶液（pH 3.6）、10 mmol/LTPTZ盐酸溶液（盐酸浓度40 mmol/L）、20 mmol/L FeCl3溶液按照10∶1∶1（V/V）混合制得FRAP工作液（现配现用）。

FeSO4标准曲线的绘制：配制不同浓度的FeSO4溶液（0、0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L），吸取0.1 mL不同浓度FeSO4溶液，加入2.9 mL FRAP工作液，混匀，于37 ℃恒温水浴10 min后在593 nm波长处测定吸光度值，以蒸馏水为参比。以吸光度值为纵坐标，FeSO4溶液浓度为横坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程：y=0.754 2x+0.076 8（R2=0.999 6）。

样品的测定：配制不同浓度梯度的样液，吸取0.1 mL不同浓度样品溶液，加入2.9 mL FRAP工作液中，混匀，于37 ℃恒温水浴10 min后在593 nm波长处测定吸光度值，以蒸馏水为参比。样品抗氧化能力以FeSO4浓度（即FRAP值）表示，同时用绍兴黄酒、0.4mg/mL VC和0.8 mg/mL Trolox作对比。

1.3.5 数据处理

所有的实验数据都是3次实验的平均值，应用Excel和SPSS 18.0软件进行统计分析，用Origin 8.6软件作图。

2 结果与分析

2.1 总黄酮和总酚含量的测定结果

通过比色法测得苦荞红曲保健酒的吸光度值，由标准曲线相关方程得到总黄酮和总酚含量分别为1 011.02 μg/mL、1 569.80 μg/mL；市售黄酒的总黄酮和总酚含量为78.06 μg/mL、778.87 μg/mL。

2.2 DPPH自由基清除能力的测定

DPPH自由基是一种很稳定的自由基，在乙醇溶剂中呈紫色，在517 nm波长处有最大吸收峰，当有自由基清除剂存在时，DPPH自由基的单电子被配对使其吸收逐渐消失，颜色变浅，且褪色程度与其接受的电子数成化学计量关系。因此，可以根据反应液在最大吸收波长处吸光度的大小来评价被测样品抗氧化能力的强弱，吸光度值越小，被测样品的抗氧化能力越强[21]。结果见图1。

图1 各样品对DPPH自由基的清除作用Fig.1 Scavenging effect of each sample on DPPH free radicals

从图1可以看出，苦荞红曲酒、绍兴黄酒、VC和Trolox对DPPH自由基均具有一定的清除能力，且苦荞红曲酒对DPPH自由基的清除能力明显高于Trolox、VC和绍兴黄酒。各样品对DPPH自由基的清除能力随着用量的增加而上升，其中苦荞红曲酒和Trolox对DPPH自由基的清除能力随用量变化的增效明显，而VC和绍兴黄酒的各浓度梯度之间DPPH自由基清除率差异不显著。样品用量在40～70 μL之间变化时，除了绍兴黄酒，其他3种样品对DPPH自由基清除率与用量之间呈现较好的线性关系，结果表明苦荞红曲酒对DPPH自由基有较好的清除能力。

2.3 ABTS自由基清除能力的测定

ABTS经活性氧氧化后生成稳定的蓝绿色阳离子自由基ABTS+，当加入的被测物质含有抗氧化成分时，该物质会与ABTS+发生反应使反应体系褪色，颜色变浅，在其最大吸收光波长734 nm下测定其吸光度值变化。根据吸光度值的大小判定被测样品抗氧化能力的强弱，吸光度值越小，被测样品抗氧化能力越强[22]，结果见图2。

图2 各样品对ABTS自由基的清除作用Fig.2 Scavenging effect of each sample on ABTS free radicals

从图2可以看出，苦荞红曲酒、绍兴黄酒、VC和Trolox对ABTS自由基均具有一定的清除能力，且苦荞红曲酒对ABTS自由基的清除能力明显高于Trolox、VC和绍兴黄酒。各样品对ABTS自由基的清除能力随着用量的增加而上升，其中苦荞红曲酒、Trolox和VC对ABTS自由基的清除能力随用量变化的增效明显，而绍兴黄酒的各浓度梯度之间ABTS自由基清除率差异不显著，结果表明苦荞红曲酒对ABTS自由基有很好的清除能力。

2.4 Fe3+还原能力的测定

FRAP法是基于氧化还原反应，在酸性pH值下，Fe3+与TPTZ形成复合物（Fe3+-TPTZ），在被测物的还原物质作用下，复合物被还原为Fe2+而呈蓝色，在593 nm波长处达到最大吸收，还原物质的含量与吸光度值的变化呈比例关系。因此，可用来判定物质的抗氧化能力，在593 nm波长处检测吸光度值，吸光度值越大，FRAP值也就越大，被测样品抗氧化能力越强[23]。结果见图3。

图3 各样品对Fe3+的还原能力Fig.3 Reducing power of each sample on Fe3+

从图3可以看出，苦荞红曲酒、绍兴黄酒、VC和Trolox对Fe3+均具有一定的还原能力，说明4种被测物都含有一定的还原性物质。且苦荞红曲酒对Fe3+的还原能力明显高于Trolox、VC和绍兴黄酒。各样品对Fe3+的还原能力随着用量的增加而上升，其中苦荞红曲酒对Fe3+的还原能力随用量变化的增效明显。而Trolox、VC和绍兴黄酒的各浓度梯度之间对Fe3+的还原能力差异不显著。

2.5 总黄酮含量、总酚含量与抗氧化能力之间的关系

根据图1～图3测定结果，采用SPSS数据分析软件，将苦荞红曲酒样品的总黄酮含量和总酚含量与其抗氧化能力作相关性分析，结果见表1。

表1 样品总黄酮、总酚含量与抗氧化相关性Table 1 Correlation between antioxidant activity and total flavonoids or total polyphenols

由表1可知，样品中的总黄酮、总酚含量对DPPH自由基、ABTS自由基的清除率和对Fe3+的还原能力呈极显著相关（P＜0.01），说明黄酮类物质、酚类物质对样品抗氧化能力有显著影响。

3 结论

本实验测定了苦荞红曲保健酒中总黄酮和总酚的含量，并且对比了苦荞红曲保健酒、市售黄酒、VC、Trolox对DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力和对Fe3+的还原能力。结果表明，随着被测样液用量的增加，其抗氧化能力也在不断增强。对相关性的分析表明，苦荞红曲保健酒黄酮及总酚含量与其对DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力和对Fe3+的还原能力之间存在极显著差异。

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