食醋中絮状物产生菌的分离鉴定及检测方法研究

薛建华，梁建明，王福中

（四川清香园调味品股份有限公司，四川 江油 621700）

我国酿醋历史悠久，庄颁著《物原类考》有载“酱成于盐，周时已有醋，一名苦酒，周时称醯，汉始称醋”[1]。近年来，食醋行业发展迅速，食醋品种不断丰富，包装容器除传统的玻璃瓶之外，塑料瓶、塑料软袋等也被广泛应用。塑料包装外观多样，且不易破碎，方便运输，但其透气性大于玻璃瓶，塑料材质尤其软袋包装的食醋中容易出现絮状物，进而影响产品质量[2]，这一现象在食醋行业中普遍存在。对食醋中絮状物的产生菌进行了分离鉴定，并确定了该菌的检测方法，采用马铃薯液体培养基最快可在24h内对结果作出判定，能有效防止不合格品出厂，对指导食醋生产具有一定的现实意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

食醋：四川清香园调味品股份有限公司提供；马铃薯：市售；酵母膏、琼脂粉（生化试剂）：北京奥博星生物技术有限责任公司；葡萄糖、碳酸钙、无水乙醇（分析纯）：成都市科龙化工试剂厂。

液体培养基：马铃薯汁1000mL，葡萄糖20g，pH5.5～6.0；

平板培养基：蒸馏水1 000mL，酵母膏10g，葡萄糖10g，无水乙醇20mL，碳酸钙15g，琼脂粉15～20g；

马铃薯汁制备方法：称取去皮、切块的马铃薯200g，加入1 000mL蒸馏水，煮沸20～30min，用多层纱布过滤，滤液加水定溶至1 000mL。

1.2 仪器与设备

SYQ-DSX-280A手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；AL204电子分析天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；EC3001生物显微镜：江西江凤仪器科技有限公司；DHG-9140A电热鼓风干燥箱：上海浦东荣丰科学仪器有限公司；SW-CJ-1D单人单面净化工作台：苏净净化设备有限公司；PHSJ-4A实验室pH计：上海精密科学仪器有限公司；MJX-250B-Z培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.3 方法

1.3.1 液体富集培养[3]

将配制好的液体培养基分装于试管，每支试管9mL，塞上棉花塞，用牛皮纸包扎，于0.15MPa蒸汽压力条件下灭菌30min，冷却备用。

在无菌操作下，取已经产生絮状物的食醋1mL，不调pH直接接入液体培养基[4]，置于30℃培养箱中培养72h。

1.3.2 平板涂布培养

平板制备：准确称取除无水乙醇外的其他培养基组分，配制后在0.15MPa蒸汽压力条件下灭菌30min，待培养基冷却至45℃左右[5]，于无菌操作下加入无水乙醇，摇匀，倾倒平板，培养基凝固后备用。

涂布培养：在无菌操作下，将富集培养的菌液用灭过菌的生理盐水，按照100、101、102的梯度进行稀释，分别取0.2mL梯度稀释的菌液至平板[6]，用涂布棒均匀涂布后置于30℃恒温箱中培养4～7d。

1.3.3 平板划线培养

平板制备：方法同1.3.2。

划线培养：在无菌操作下，用接种环分别挑取涂布培养形成的单一菌落进行平板划线，然后置于30℃培养箱中培养4～7d。

1.3.4 验证试验[7]

挑取划线培养的纯菌落再接入灭菌后的液体培养基中，于30℃培养箱中培养72h，观察是否有絮状物产生，从而筛选出目标菌。

1.3.5 初步鉴定

针对目标菌，根据《伯杰细菌鉴定手册》[8]和《常见细菌系统鉴定手册》[9]进行初步鉴定。

1.3.6 检测方法优化

对葡萄糖、pH值及培养温度3个因子进行L9（34）正交试验[10]，找出食醋絮状物产生菌的最佳检测方法。

2 结果与讨论

2.1 微生物的分离纯化

通过液体富集培养、平板涂布及划线培养，从产生絮状物的食醋中得到A、B、C 3种微生物，其菌落形态见图1。

图1 分离出的三种微生物菌落形态图Fig.1 Colonial morphology of three kinds of microbes isolated from vinegar

2.2 验证结果

将A、B、C 3株菌分别接入灭菌后的液体培养基中，每组各接3支试管，于30℃培养箱中培养。C菌株在接种48h后3支试管均产生絮状物，A菌株和B菌株培养96h后仍无絮状物产生，因此确定C菌株为食醋中产生絮状物的目标菌。

2.3 目标菌初步鉴定结果

对平板划线培养的目标菌进行鉴定，其菌落小而突起，苍白色，边缘规则、整齐，光滑、湿润，易于挑取；镜检菌体呈杆状，单个、成对或成链；对照《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》，结果见表1，初步鉴定该菌为葡糖杆菌属（Gluconobacter）。可氧化乙醇得乙酸，但由于细胞中缺少琥珀酸脱氢酶，没有完整的三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA）途径，因而不能将乙酸或乙酸盐进一步氧化成CO2和H2O[11]。能通过己糖-磷酸盐途径分解代谢D-葡萄糖，并从D-葡萄糖产生2-酮基葡萄糖酸和5-酮基葡萄糖酸[12]。

2.4 检测参数确定

为了缩短检出食醋成品中是否存在絮状物产生菌的时间，更好地指导生产，防止问题产品出厂，有必要对该菌的检测方法进行优化。试验在液体富集培养及单因素预试验的基础上，确定葡萄糖、pH值及培养温度3个因子，每个因子选择3个水平，进行L9（34）正交试验，并根据液体培养基中絮状物产生的时间进行记录。因子水平表见表2，试验结果与分析见表2、表3。

表1 絮状物产生菌初步鉴定结果Table 1 Preliminary identification results of floccules strains

表2 絮状物产生菌检测条件优化正交因素与水平Table 2 Factor and levels of orthogonal experiment for optimization of floccules strains detection conditions

表3 絮状物产生菌检测条件优化正交试验结果与分析Table 3 Result and analysis of orthogonal experiment for optimization of floccules strains detection conditions

由表3所得极差R可知，对絮状物产生菌检测结果的影响依次为：葡萄糖＞培养温度＞pH值；由表4可知，因子A影响极显著，因子C影响显著，因子B影响不显著，因此，确定食醋中絮状物产生菌检测方法各因子的最佳水平为A3B3C2，即葡萄糖3g/100mL，pH值6.0，培养温度28℃。

表4 絮状物产生菌检测条件优化正交试验结果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiment for optimization of floccules strains detection conditions

2.5 检测方法验证及确定

按照2.4中确定的参数配制马铃薯液体培养基，分装于试管，每支试管9mL，塞上棉花塞，用牛皮纸包扎，于0.15MPa蒸汽压力条件下灭菌30min，冷却备用。

在无菌操作下，取上述试管4支，其中3支接入有絮状物的食醋，余下1支作为空白对照，接种后置于28℃培养箱中培养，观察结果（图2）：接有絮状物食醋的3支试管均在24h内产生絮状物；48h后絮状物在液体培养基表面聚集形成凝胶膜[13]，当膜达到一定厚度便开始下沉，絮状物继续聚集然后在液体表面产生新的凝胶膜；空白对照无絮状物、凝胶膜产生。由此确定食醋絮状物产生菌的检测方法如下：

图2 24h、48h絮状物和空白对比Fig.2 Comparison of floccules and blank after 24 h and 48 h

2.5.1 马铃薯液体培养基

马铃薯汁1 000mL，葡萄糖20g，pH值6.0；

马铃薯汁制备方法：称取去皮、切块的土豆200g，加入1 000mL蒸馏水，煮沸20～30min，用多层纱布过滤，滤液加水定容至1 000mL。

2.5.2 分装、灭菌

每支试管装入9mL马铃薯液体培养基，塞上棉花塞，用牛皮纸包扎，于0.15MPa蒸汽压力条件下灭菌30min，冷却备用。

2.5.3 接种培养

在无菌操作下，取食醋1mL不调pH，直接接入试管液体培养基中，摇匀，塞上棉花塞，置于28℃培养箱中培养。每组待测样至少做3支试管，同时做空白对照。

2.5.4 结果判定

24h内，每组待测样只要1支试管有絮状物产生，而对照组无此现象，即可判定不合格；若待测样的每支试管均无絮状物产生，则继续培养72h，每支试管均无絮状物产生方可判定合格。

3 结论

从食醋中分离到的絮状物产生菌为葡糖杆菌属，其是醋酸菌科（Acetobacteraceae）的一个重要属，与醋杆菌属和葡糖酸杆菌菌属菌株大多生长在富醇的培养基不同，葡糖醋杆菌属菌株一般生长在含糖丰富的环境中[14]，可出现在花、园土、啤酒酵母、果实、葡萄酒、苹果酒、啤酒、南非班图酒、酒醋、软饮料等[15]。采用马铃薯液体培养基，在葡萄糖3g/100mL，pH值6.0的条件下，于28℃培养最快可在24h内检出，有利于指导生产，预防食醋尤其袋装食醋货架期出现絮状物影响产品品质。

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