低温下鲜切莲藕菌相分析及货架期评价

夏天龙，易 阳，王宏勋*，黄良仟

（武汉轻工大学 食品科学与工程学院，湖北 武汉 430023）

鲜切果蔬指经过分级、整理、挑选、清洗、切割、保鲜、包装等处理后保持新鲜状态的制品，是可直接烹饪或直接食用的成品果蔬[1-3]。加工过程中，由于切割使得细胞受损，失去了组织的完整性，易受到空气、加工用水及加工机械中各种微生物的污染[4-5]，微生物的变化成为产品营养、感官品质以及安全性下降的主要原因之一[6-10]。在贮藏过程中，受环境温度、氧气含量、包装材料等方面影响，微生物种类、数量及变化趋势也会不同[11-12]。莲藕具有较高的营养价值和药用价值[13]，真空包装净菜莲藕由于其方便性，已经成为莲藕销售的新形式。真空包装能降低氧含量，抑制微生物呼吸作用，延长货架期。目前对于鲜切果蔬研究主要集中于保鲜剂的筛选、抑制褐变、微生物控制方法、产品开发等[14-18]，对菌相分析及微生物变化规律研究较少。以真空包装鲜切莲藕为研究对象，对其菌相组成进行初步分析及鉴定，评价微生物变化趋势与货架期的关系，为真空包装鲜切莲藕品质控制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

莲藕（购自武汉如意集团）：选取新鲜、健壮、成熟度适中，藕节完整，无腐烂变质，无机械伤的市售带泥莲藕，洗净去皮后切为片状（厚度约3mm），真空包装。

MRS琼脂培养基、紫红胆盐萄葡糖琼脂培养基（violet red bile dextrose agar，VRBDA）、假单胞菌CFC选择性培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA）、革兰氏染色液、糖醇类发酵培养基、细菌鉴定管均购自青岛海博生物技术有限公司；氯化钠（优级纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

TC-400B真空包装机：上海星贝包装机械有限公司；SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台：苏州净化设备有限公司；MIR-154型低温培养箱：三洋电机国际贸易有限公司；LRH-150-S恒温恒湿培养箱：广东省医疗器械厂；HBM-400系列样品均质器：天津市恒奥科技发展有限公司；CP214（C）型电子天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司；XFS-280A手提式蒸汽不锈钢灭菌锅：上海三申医疗器械有限公司。

1.3 鲜切莲藕菌相分析及变化规律研究

1.3.1 莲藕中腐败微生物生长曲线

将真空包装的鲜切莲藕产品恒温贮藏于4℃低温培养箱内，用MRS、VRBDA、CFC、PDA等选择性培养基监测产品中乳酸菌、肠杆菌、假单胞菌、酵母菌数量。方法参照GB/T4789.2—2008《食品微生物学检验菌落数测定》[19]。具体的选择性培养基及培养条件见表1。

表1 不同微生物的选择性培养基及培养条件Table 1 Selective medium,culture time and temperature for isolating different bacteria

1.3.2 建立莲藕中微生物生长模型

运用SAS9.1软件，用Gompertz[20]模型拟合各微生物生长曲线的数学模型。Gompertz数学方程为：lgN（t）=N0+C×exp{-exp[-B（t-M）]}，式中t为时间，d；N0为初始微生物数量对数值，lg（CFU/g）；C是微生物稳定期数量与初始值之差，lg（CFU/g）；B是最大生长速率，d-1；M为最大生长速率时所对应的时间，即曲线拐点所对应的时间，h。

并由上式可计算出微生物生长的延滞期（lag phase，LPD）以及微生物生长的最大比生长速率U。其中，LPD=M-（1/B），d；U=B×C/e，e=2.718 2，d-1。

1.3.3 生长模型验证

通过准确因子（Af）和偏差因子（Bf）可验证模型构建的准确度[21]。

1.4 腐败限控量的确定

通过真空包装鲜切莲藕的感官可接受度检测产品货架期，并确定腐败菌的腐败限控量。

参考标准NY/T 1987—2011《鲜切蔬菜》[3]中对鲜切蔬菜感官要求，以包装指标、色泽、气味和组织结构为感官指标，建立评定小组进行感官分析，见表2。0分为最好品质，4分为商品界限，4分以上为不可接受。

表2 真空包装鲜切莲藕感官评价评分表Table 2 Sensory evaluation sheet of vacuum-packed fresh-cut lotus root

1.5 腐败微生物的分离

从选择性培养基中选取形态典型的菌落，采用相应的选择性培养基以平板划线法进行分离纯化，获得纯化菌株。

1.6 腐败微生物的初步鉴定

1.6.1 菌落形态观察

观察已分离纯化的单个菌落的含水状态、外观形态、透明度、菌落与培养基结合程度、颜色、菌落正反面颜色的差别、边缘整齐度、气味等特征。

1.6.2 个体形态观察

挑取菌落进行革兰氏染色观察，描述细胞的形状和细胞间的排列方式，并进行显微照相。

1.6.3 生理生化试验

根据《常见细菌系统鉴定手册》[22]对分离纯化菌株进行糖醇发酵试验、L-精氨酸双水解酶试验、鸟氨酸脱羧酶试验、赖氨酸脱羧酶试验、尿素酶试验、硫化氢试验、蛋白胨水（色氨酸肉汤）发酵管试验、Voges-Proskauer（V-P）试验、西蒙氏枸橼酸盐试验、邻硝基苯-β-半乳糖苷（ortho-nitrophenyl-β-galactoside，ONPG）试验。

2 结果与分析

2.1 腐败微生物分离与鉴定

采用MRS、VRBDA、CFC、PDA等选择性培养基从莲藕中分离出乳酸菌属、肠杆菌科、假单胞菌属、酵母菌属各2株。相关菌落形态观察见表3，其显微结构见图1。

2.2 腐败微生物生理生化特征

生理生化试验结果见表4。菌株M-1、M-2符合乳酸菌相关特征，菌株V-1、V-2符合肠杆菌相关特征，菌株C-1、C-2符合假单胞菌相关特征，菌株P-1、P-2符合酵母菌相关特征。同一科（属）的两株微生物的糖醇发酵、水解酶、脱羧酶、西蒙氏枸橼酸盐等鉴定结果不完全一致，说明2株微生物为同科不同属，或同属不同种微生物，这与其显微结构差异的结果一致。

表3 鲜切莲藕中微生物菌落形态特征Table 3 Microbial colony morphology of vacuum-packed fresh-cut lotus root

图1 分离的微生物显微照片Fig.1 Photomicrograph of the isolated microorganisms

表4 鲜切莲藕中微生物腐败细菌生理生化试验结果Table 4 Physiological and biochemical properties of the microorganisms in vacuum-packed fresh-cut lotus root

2.3 贮藏过程微生物变化规律与货架期

采用选择性培养基对真空包装鲜切莲藕中不同微生物进行平板计数，监测4℃贮藏过程中莲藕腐败菌的生长情况。运用Gompertz模型拟合乳酸菌、肠杆菌、假单胞菌、酵母菌生长一级模型，其生长曲线真实值和预测值由图2可见。由该模型方程回归得到酵母菌的生长动力模型、相关动力学参数及模型的验证见表5。

4种微生物的Af、Bf均接近1，其预测值和真实值之间偏差很小，说明模型能很好地拟合微生物的生长状况。酵母菌的初始菌落数最多，且在整个贮藏过程中的数量有相对优势；肠杆菌和假单胞菌数量在贮藏初始阶段呈现下降，可能是应对于贮藏温度急剧变化的微生物适应过程，其繁殖代谢受到一定抑制。乳酸菌延滞期较短；假单胞菌延滞期较长，但最大比生长速率较大；酵母菌与肠杆菌的延滞期及最大比生长速率基本相似。4种微生物的生长动力学参数差异较小，基本可以判定乳酸菌、酵母菌、肠杆菌、假单胞菌均为真空包装鲜切莲藕的主要腐败菌。

2.4 鲜切莲藕贮藏期间感官品质变化

图2 4℃腐败微生物在鲜切莲藕上的生长拟合曲线Fig.2 Fitting growth curves of microorganisms in fresh-cut lotus root at 4°C

表5 莲藕中微生物的生长动力学模型和参数Table 5 Growth kinetics model and parameters of microorganisms isolated from lotus root

图3 鲜切莲藕贮藏期间感官质量评分Fig.3 Sensory quality score of fresh-cut lotus root during storage

由图3可知，鲜切莲藕的感官品质随着贮藏时间的延长不断下降，且与腐败微生物的增殖成正相关。在4℃条件下贮藏10d，各腐败微生物生长基本达到稳定期，莲藕感官评分为4分，鲜切莲藕局部褐变，未显现出可观察的腐败现象。10d之后，部分莲藕切片发生感官不可接受的褐变及腐败现象，失去商品价值。通过鲜切莲藕在贮藏期间的感官品质变化确定微生物的限控值为107CFU/g。

3 结论

通过对真空包装鲜切莲藕中菌相组成及其变化趋势进行研究，发现鲜切莲藕中主要优势菌为乳酸菌、肠杆菌、假单胞菌和酵母菌。各微生物数量均随着贮藏时间的延长而增加，而莲藕感官品质随之下降，其中乳酸菌延滞期最短，假单胞菌最大比生长率最高，酵母菌数量优势相对较大。该莲藕产品的货架期为10d左右，所对应的微生物数量级约107CFU/g。后期在研究基于腐败微生物控制延长鲜切莲藕货架期时，应该针对多种微生物采取抑菌措施。

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