皖北地区杨树叶锈病病原鉴定与发生规律的初步研究

宋敏，洪少民，常广荣，张明，李珂，孙翀，任德珠

（1.蚌埠市森防站，安徽蚌埠 233000；2.怀远县林业局）

皖北地区杨树叶锈病病原鉴定与发生规律的初步研究

宋敏1，洪少民2，常广荣1，张明2，李珂1，孙翀1，任德珠1

（1.蚌埠市森防站，安徽蚌埠 233000；2.怀远县林业局）

本文对杨树叶锈病在皖北地区的发病特点、病原菌形态进行了初步研究，分析了锈病发生与品种、林地管理、降水和湿度等因素的关系，结合现代分子生物学分类技术将病原菌鉴定为落叶松-杨栅锈菌。研究表明，杨树叶锈病在皖北地区一年只有秋季一次高发期；锈病的发生与多种因素关系密切；在无转主寄主的情况下可以连年危害。

杨树叶锈病；落叶松-杨栅锈菌；病原鉴定；皖北地区

杨树作为重要的速生用材和防护林树种，易繁殖、生长快、效益高、适生性强，是皖北地区最主要的造林树种之一。在我国，杨树是东北、西北、华北和西南地区用材林、防护林、薪炭林以及“四旁”绿化的重要树种[1]。随着安徽省绿色长廊、退耕还林、长防林等重点工程项目的实施，皖北杨树种植规模逐年扩大，仅蚌埠市杨树面积就达7.6万hm2，杨树活立木蓄积量约450万m3，杨树在本地区生态建设、地方经济发展和林业产业发展中发挥着不可替代的作用。随着杨树资源的扩增，近年来本地区杨树叶锈病普遍发生并愈来愈严重。国内对杨树叶锈病的研究主要集中在胡杨锈病、新疆杨锈病、落叶松杨栅锈病等北方地区发生的杨树锈病[2-3]。鉴于杨树叶锈病在皖北地区的发生侵染规律尚不清楚，病原菌种类不明确，为此，本文对杨树叶锈病在本地区的发生规律、病原菌种类等进行了初步研究。

1 材料和方法

1.1 研究地点和材料

研究地点位于安徽省蚌埠市杨树叶锈病发生区。蚌埠市地处安徽省北部、淮北平原南端。116°45′～118°04′E，32°43′～33°30′N，淮河自西向东过境。北亚热带和暖温带的过渡带，气候温和，四季分明，光、热充足，年平均日照时数≥2 200 h，年平均气温15.4℃，≥10℃积温4 813℃。多年平均无霜期218 d，平均初霜期11月2日，终霜期3月28日。年均降雨量905.4mm，降水主要分布在夏季，6～8月份降水量约占全年的49%。

杨树叶锈病病原菌鉴定样品来自本地感染杨树叶锈病的病叶。

1.2 研究方法

1.2.1 病情监测与发病规律调查

2011年～2013年，每年5月、7月、9月～10月在全市范围各开展杨树叶锈病专项普查一次，实施动态监测。选择锈病发生较普遍和严重的地块，根据杨树品种、林龄、郁闭度、管理状况不同，设立20个固定监测样地，40个临时监测样地，分品种、林地管理水平等因素定期调查病情。在样地内随机选择50株杨树标准株，从样株表现初始症状开始，每隔15 d调查一次发病程度。按分级计数法计算病情指数（分级标准见表1）。同期同步进行气象数据采集并记录。通过踏查和标准地调查，综合分析杨树叶锈病的发生与杨树品种、降水、郁闭度、管理状况的相关性，总结杨树叶锈病发病规律、特点。1.2.2杨树叶锈病病原形态鉴定

表1 杨树叶锈病分级标准

2012年9月、11月，从发生区林地采集杨树叶锈病病叶样品，用徒手切片法制作组织样片，在高倍显微镜下观察病原菌形态，在显微镜下测量30个夏孢子大小，进行初步鉴定。

1.2.3 杨树叶锈病病原分子生物学鉴定

（1）菌株ITS1-5.8S-ITS2 rDNA（下简称ITS）区域的扩增。采用DNA提取试剂盒制备杨树叶锈病原菌基因组DNA，扩增引物为ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'），采用聚合酶链式扩增反应（PCR）获得病原菌的ITS区基因片段[4]，见表2。

表2 PCR扩增体系

扩增反应在Eppenddorf AG22331 PCR仪上进行。

扩增程序：94℃变性5min，（94℃变性1 min，52℃退火1min，72℃延伸1min）×30，72℃延伸10 min，4℃保温。取5μL PCR产物，用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。PCR扩增产物序列交由上海英潍捷基生物技术有限公司测定。

（2）分子系统进化树的构建。为研究供试菌株与已知栅锈菌的亲缘关系及其系统地位，在GenBank上下载相关近缘种酵母菌菌株的ITS rDNA区域序列与供试菌株的序列放在一起，用BioEdit软件进行匹配排列，使用MEGA4.1软件，并采用Neighbor-Jioning方法构建分支系统树和Bootstrap analysis方法进行1 000次重复抽样分析[4]。

2 结果与分析

2.1 杨树叶锈病病原物形态观察与鉴定

2.1.1 病菌孢子形态

（1）夏孢子形态。杨树叶锈病夏孢子堆初期主要生于叶的背面。初期叶背面生长少量黄色丘疹状斑点，后叶表皮破裂散放出橘黄色粉状物，为夏孢子堆。严重发病时黄粉布满整个叶背面，影响光合作用，加之叶表皮破裂使叶片大量失水，导致叶片焦枯，提前落叶，降低林木生长量，影响生态和景观。显微镜下观察（表3），夏孢子单胞；淡黄色或晶白色；圆形、椭圆或卵形；大小（28～40）μm×（19.6～25）μm；孢子壁在“赤道处”略微加厚；表面有较少的疣状刺。

表3 显微镜下观察夏孢子大小及形状（摘录）

（2）冬孢子堆形态。11月中下旬在叶正面出现棕褐色、呈痂疤状的病症，为冬孢子堆，冬孢子堆生于叶表皮下。

2.1.2 病菌形态分类鉴定

目前，对于杨树叶锈菌的分类，主要是以夏孢子的形状、大小、壁厚的均匀度、表面小刺的形状和分布、侧丝以及冬孢子形态、其在叶面的着生部位作为分类依据。本文将采集的杨树叶锈病病原菌鉴别形态与国内外已报道的杨树叶锈病病原菌特征进行比照分析，根据检索表（表4）初步鉴别蚌埠杨树叶锈病病原菌与落叶松-杨栅锈菌（Melampsoralarici-populinaKleb.）较为一致。

表4 常见杨树叶锈病检索表

2.1.3 原菌分子分类鉴定结果

采用DNA提取试剂盒制备基因组DNA，通过PCR扩增法得到该病原菌的ITS区基因片段，取5 μL PCR产物，用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，如图1所示，长度约700 bp。

图1 锈病病原ITS rDNA序列PCR产物的电泳图谱

杨树叶锈病病原菌的ITS区序列长度为684 bp，在GenBank数据库中进行同源序列搜索（BLAST search），结果显示，该病原菌和落叶松-杨栅锈菌（Melampsora larici-populina）（GenBank No. JQ912668）的ITS区序列相似性为100%。从GenBank下载相似序列构建系统发育树，从图2中可以看出该病原菌和落叶松-杨栅锈菌聚在一组，自举支持率100%，和马格栅锈菌（Melampsora magnusiana）相距甚远。因此，综合杨树叶锈病病原菌的形态、孢子和ITS rDNA序列把该菌鉴定为落叶松-杨栅锈菌。

图2 栅锈菌属部分菌株的ITS区域分支系统树

2.2 杨树叶锈病的发生规律

2.2.1 病害与转主寄主的关系

本地区杨树叶锈病的病原菌鉴定为落叶松-杨栅锈菌，而本地区远离落叶松林。对于杨树叶锈病没有转主寄主仍能连年危害的现象以往已有研究报道。有作者认为，落叶松-杨栅锈菌在落叶松不能生长的温暖地方，可以夏孢子越冬，夏孢子的存活力和致病性在干燥情况下可达10个月之久，在越冬后仍有致病性，因此即使没有转主，该菌也能以夏孢子越冬连续为害[3]。

2.2.2 病害与降水及湿度的关系

根据调查，密度大、通风透光不良的林分，空气相对湿度高，发病早而重；反之则发病晚而轻。2011年10月份调查，11块郁闭度0.6以上的标准地，平均病情指数60.6；同期8块郁闭度0.5以下的标准地，平均病情指数36.8。

根据调查，杨树叶锈病发病程度与夏季降水时长关系密切。2011年7～8月，阴雨时间陆续长达48 d（其余14 d为多云天气），10月上旬杨树叶锈病病情指数平均50.4；2012年7～8月调查区干旱少雨，阴雨时间仅26 d（其余36 d为多云或晴天），10月上旬锈病病情指数平均32.6，发生相对2011年同期较轻。

2.2.3 病害与杨树品种的关系

连续3年的监测调查发现，相似的气候因素和立地条件下，杨树品种不同，发生杨树叶锈病的情况差异较大。调查显示，107杨感病不明显，症状轻微；中林46杨在本地区通常从8月初开始出现黑斑病害并逐渐落叶，发病高峰期先于叶锈病，较少发现锈病危害；近年繁育推广的彩叶品种红叶杨（2025杨芽变品种）目前处于苗期及幼林阶段，未发现叶锈病症状，表现出较强的抗性；I-69杨在本地表现易感染锈病，且部分区域感病严重。在调查中还发现，当I-69杨树叶片上有白粉病发生时，白粉病发病区域不会出现叶锈菌夏孢子堆，同样叶锈病发病区域也不会出现白粉菌孢子堆，常在一个叶片上可同时见到泾渭分明的白粉病发病区域和叶锈病发病区域，似乎不同病菌孢子具有排他特性，这种现象有待进一步研究。

2.2.4 病害与杨树叶片距地面高度的关系

根据调查，本地区杨树叶锈病，均从树冠下部叶片先表现症状，越接近树冠下层，染病越重；距地面越高，染病越轻，自下而上呈逐渐减轻的趋势。德国林业专家迪特·泽曼博士（Mr.Dieter Seemann）在对蚌埠市杨树叶锈病发生情况实地考察和研究后，也得出相似观点。出现这种状况原因可能有两种：一是杨树叶锈病的病原菌主要宿存于林下的枯落病叶，夏季雨水迸溅等多种因素助力夏孢子的传播，传播顺序由下往上；二是成林大树下部的叶片主要由冬芽发育而成，发叶早，冬芽可能带有越冬的病菌菌丝，导致下部叶片受病菌侵染的时间早且长。综合这两个因素，处在树冠下层的树叶发病早而重。

2.2.5 病害与林地管理水平的关系

根据调查，采取修枝除草、深冬清理地表枯枝落叶层等管理措施的林分，林相整齐、林内少有杂草枯叶，杨树生长好，发病轻或未发现症状；管理粗放的林分，林内杂草枯叶多，杨树生长不良，发病较重。

此外，连续3年的林间调查记录显示，各监测点杨树在春季均未发现锈病症状，8月下旬为锈病始现期，9月至10月为发病盛期，发病林木在次年春季展叶推迟。“杨树叶锈病在本地区一年只有秋季一次高发期”这一结论与多地研究认为杨树叶锈病一年有春、秋两次高发期观点区别明显[5-6]。

3 结论

3.1 病原鉴定

综合病原菌的形态特征和ITS rDNA序列，研究鉴定本地区杨树叶锈病病原菌为落叶松-杨栅锈菌（Melampsora larici-populina）。

3.2 发病规律

杨树叶锈病在本地区一年只有秋季一次高发期；该病发生与转主寄主落叶松关联不密切，在没有落叶松分布的区域，该菌也可以夏孢子越冬或以冬芽内的菌丝越冬引起翌年侵染；不同品种其发病程度不同，本地主栽的两个杨树品种I-69杨和中林46，其中中林46杨以前易感染锈病，近年来因黑斑病导致其早期落叶，因而遭受感染的机会较少；而对黑斑病高抗的I-69杨，却成为易感染锈病的品种。杨树叶锈病发病程度与夏季降水时长呈现正相关，夏季阴雨时间越长，病害越重。病害与林地管理水平有一定的关系，采取修枝、翻耕、施肥等管理措施的林分，杨树生长好，叶锈病发病轻；管理粗放的林分，林内杂草枯叶多，杨树生长不良，发病较重。

[1]郑世锴，高瑞桐.杨树丰产栽培与病虫害防治[M].北京：金盾出版社，1996.109-113.

[2]马占鸿，杜荣，汪万文．新疆杨锈病的发生与防治试验简报[J]．宁夏农林科技，1991（2）：24-25．

[3]孟繁荣，薛煜，黄永青．青杨树叶锈病的研究[J]．林业科技，1992，17（2）：33-35．

[4]马忠友，程飞，邱亮，等．一株产植酸酶酵母菌株的分类鉴定与诱变育种[J]．食品与发酵工业，2011，04：21-25．

[5]丁维泽，沈树祥，陈义高．杨树叶锈病的发生与防治[J]．农家致富，2004（6）：36．

[6]李瀚，曾汉青．青杨树叶锈病的流行规律及防治技术[J]．陕西林业科技，1999（3）：5l-53．

（责任编辑：杨婷婷）

Study on the Pathogen Identification and Occurrence Regularities of the Poplar Leaf Rust in Northern Anhui Province

SONG Min1，HONG Shaomin2，CHANG Guangrong1，ZHANG Ming2，LI Ke1，SUN Chong1，REN Dezhu1
（1.Forest Pest and Disease Control and Quarantine Station of Bengbu City，Bengbu 233000，Anhui，China；2.Forestry Bureau of Huaiyuan County）

In this paper a preliminary study was made on the characteristics of the poplar leaf rust and its pathogen morphology in northern Anhui Province.The relationship between the rust occurrence and factors including the poplar varieties，forestland management，precipitation and humidity was analyzed.The pathogen was identified as Melampsora laricipopulina，with modern molecular biology classification technologies.The study showed that the poplar leaf rust has only one high-incidence period in autumn in northern Anhui，its occurrence is closely related with many factors and the disease can harm poplar leaves in consecutive years in case of no alternate hosts.

Poplar leaf rust；Melampsora larici-populina；Pathogen identification；Northern Anhui Province

S763.1

A

2095-0152（2014）06-0010-04

2014-10-27

2014-11-05

蚌埠市科技项目（编号蚌科-2011-33）。

宋敏（1968-），女，高级工程师，主要从事森林病虫害防治及林业技术推广工作。E-mail：bbslyjck@163.com