鹅细小病毒NS1蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

孙敏华，董嘉文，李林林，袁建丰，邝瑞欢，胡奇林，张建峰

（广东省农业科学院动物卫生研究所 广东省兽医公共卫生公共实验室，广州 510640）

研究论文

鹅细小病毒NS1蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

孙敏华，董嘉文，李林林，袁建丰，邝瑞欢，胡奇林，张建峰

（广东省农业科学院动物卫生研究所 广东省兽医公共卫生公共实验室，广州 510640）

本研究克隆了鹅细小病毒（Goose parvovirus，GPV）佛山株（Foshan-2009）的NS1基因，并将其克隆至原核表达载体pET32a（+），构建重组质粒pET32a-NS1。经转化，IPTG诱导表达及SDS-PAGE和Western blot分析表明，NS1蛋白得到了表达，并且能与抗GPV的番鸭血清发生特异性反应。通过棋盘法确定NS1蛋白包被量为0.5 μg/孔，待检血清1:50稀释，HRP标记的兔抗鸭二抗1:10 000倍稀释时ELISA反应条件最佳，并确定阴阳性临界值为0.399。该ELISA方法特异性强，与番鸭细小病毒、鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒、新城疫病毒和鸭疫里默氏杆菌的阳性血清均无交叉反应；重复性好，批内和批间重复试验的变异系数分别小于5%和10%；检出率高，GPV阳性番鸭血清的检出率为92%。本研究所建立的间接ELISA方法为鹅细小病毒的血清学诊断和流行病学监测奠定了基础。

鹅细小病毒；NS1 蛋白；ELISA

鹅细小病毒病或称小鹅瘟，是由鹅细小病毒（Goose parvovirus，GPV）引起的雏鹅和雏番鸭的一种急性或亚急性败血性传染病[1]。该病于1956年由方定一教授首次在江苏省扬州市发现。GPV主要侵害3～20日龄的雏鹅和雏番鸭，传播快，发病率和死亡率较高，特征表现为水样腹泻，渗出性肠炎，甚至腊肠样栓塞[2]。

GPV基因组长约5.1 kb，可编码5种蛋白，包括2种非结构蛋白（NS1和NS2）和3种结构蛋白（VP1、VP2和VP3）。NS1和NS2蛋白在病毒复制早期产生，其中NS1 基因含有1884个核苷酸，编码628个氨基酸，NS1 蛋白参与病毒对细胞的毒性作用、病毒复制及基因表达[3,4]。目前，基于NS1蛋白的血清学检测方法研究较少[5-7]，因此本研究利用pET32a（+）成功表达NS1蛋白，随后利用重组表达蛋白作为包被抗原，建立了GPV-NS1间接ELISA 抗体检测方法，为鹅细小病毒病的诊断以及血清学调查奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 病毒、菌株、质粒和试剂GPV分离株、GPV弱毒疫苗免疫阳性血清、Rosseta感受态细胞和pET32a（+）质粒由本实验室鉴定、保存；BamHI、XhoHII、T4DNA连接酶和MiniBest病毒RNA/DNA抽提试剂盒购于宝生物工程有限公司；DNA胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自天根生物科技公司；预染蛋白质Marker购于Fermentas公司；兔抗鸭IgG购自Nordic公司；OPD购自北京鼎国生物技术公司；大肠杆菌工程菌株DH5α、Rosetta、pET32a(+)为本实验室保存。

1.2 引物及NS1基因的PCR扩增根据GenBank中GPVNS1基因的ORF序列，利用Oligo6.0设计了扩增NS1基因的引物，预期扩增片断为1884bp。引物由上海英潍捷基生物技术有限公司合成，NS1-U：GGATCCATGGCACTTTCTAGGCCTC（BamHI），NS1-L：CTCGAGTTATTGTTCATTTTCAGCATC（XhoI）。参考文献[8]进行PCR扩增并回收目的片段。

1.3 NS1蛋白的表达、纯化及Westernblot检测参考文献[8,9]中的方法进行pET32a-NS1载体构建，并用1mmol/LIPTG诱导阳性菌蛋白表达，随后进行蛋白可溶性分析，利用Ni-NTAHis·Bind（Novagen）进行蛋白纯化及Westernblot检测。

1.4 抗原最佳包被浓度和最佳血清稀释度的确定用棋盘方阵滴定法，将纯化后的NS1蛋白用0.05mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液从80μg/mL依次进行倍比稀释（80、40、20、10、5、2.5μg/mL），每孔100μL包被酶标板，4℃包被过夜。然后弃去孔内溶液，用PBST洗3次后，加入含0.2%明胶的PBST37℃封闭1h。阳性血清和阴性血清分别按1:50、1:100进行倍比稀释，37℃作用1h后，洗涤3次，再加入1:10000稀释的兔抗鸭二抗，37℃作用1h，洗涤3次后拍干。加入新鲜配制的OPD底物显色液，作用10min，再加入2mol/L硫酸50μL/孔终止反应，用酶标仪测定OD490值。

1.5 间接ELISA阴性和阳性临界值的确定用上述建立的间接ELISA方法，对实验室保存的56份番鸭GPV阴性血清进行检测，根据OD490值计算样本的平均值（x）和标准方差（s）。依照统计学原则，样本的OD490值＞阴性样本OD平均值（x）+3×s（标准方差）时，可以在99.9%的水平上判定为阳性。

1.6 特异性试验用建立的ELISA方法分别检测番鸭细小病毒（Muscovyduckparvovirus，MPV）、鸭瘟病毒（Duckenteritisvirus，DEV）、鸭肝炎病毒（Duckhepatitisvirus，DHV）、新城疫病毒（Newcastlediseasevirus，NDV）和鸭疫里默氏杆菌（Riemerellaanatipestifer，RA）阳性血清，以验证本试验建立的间接ELISA方法是否与其他病毒或细菌的阳性血清存在交叉反应。

1.7 敏感性试验按最佳反应条件进行试验，将GPV阳性血清按1:50～1:400倍比稀释，其余条件按1.4 中最佳反应条件进行。

1.8 重复性试验批内重复性试验：用建立的间接ELISA方法测定3份GPV阳性番鸭血清和3份GPV阴性番鸭血清，在最佳反应条件下每份血清在同一块NS1蛋白包被的酶标板上进行反应，每份血清平行进行3次重复，根据每份血清的OD490值计算出平均值和标准差，再计算出每份血清OD490值的板内变异系数。批间重复性试验：将NS1蛋白按最佳包被浓度包被ELISA板，不同时间进行3次试验，分别对3份GPV阳性血清和3份阴性血清进行间接ELISA检测，结果进行统计学分析。

1.9 间接ELISA方法的临床应用用建立的ELISA方法检测本实验室采集的种番鸭群免疫GPV的阳性血清样品88份，计算阳性检出率。

2 结果

2.1 NS1基因的扩增及其表达片化鉴定经PCR扩增后，1%凝胶电泳检测可见与预期片断（1884 bp）相符的DNA条带（结果未显示）。经序列测定后证实为GPV NS1基因，其与GPV LN-1/06分离株的NS1基因相似性高达99%（结果未显示）。

将扩增目的片段克隆入pET32a(+)载体，成功构建pET32a-NS1载体。将鉴定正确的pET32a-NS1阳性菌经1 mmol/L IPTG诱导后，SDS-PAGE分析表明，约在92 kDa处出现一条与NS1蛋白预期表达大小相符合的蛋白条带，而未诱导菌无表达。经可溶性分析表明，该蛋白以包涵体形式存在。随后，利用镍柱进行了蛋白纯化（图1），Western blot结果显示，该重组蛋白能与GPV阳性血清反应（图2），表明所表达的NS1蛋白抗原性良好。

图1 pET32a-NS1重组蛋白纯化后SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of purif ed recombination protein pET32a-NS1

图2 pET32a-NS1重组蛋白免疫印迹分析Fig.2 Western blot analysis of pET32a-NS1

2.2 抗原最佳包被浓度和最佳血清稀释度的确定方阵滴定显示，当血清的稀释度为1:50，抗原包被量为0.5 μg/孔时（表1），阳性血清的OD490值可达0.932，而对应孔阴性血清的OD490值为0.190，阴性与阳性血清的OD490比值大（P/N=4.905），且阳性血清OD值最接近1。因此，选择1:50为最佳血清稀释度，0.5 μg /孔为抗原的最佳包被量。

2.3 间接ELISA阴阳性临界值的确定对36份GPV阴性血清进行间接ELISA检测，其平均值x为0.234，标准差s为0.055。根据公式：阴阳性临界值=x+3×s，试验临界值为0.399。即待测样品的OD490值≥0.399时为阳性，OD490值＜0.399则为阴性。

2.4 特异性试验用建立的间接ELISA方法对GPV、MPV、DEV、DHV、NDV和RA的阳性血清进行测定，其OD490值如表2所示，这些血清的OD490值均小于阴阳性临界值0.399。

2.5 敏感性试验按最佳条件进行包被，将GPV阳性血清分别1:50～1:400倍比稀释后，进行间接ELISA。结果显示，当阳性血清1:200稀释时，其OD值仍然大于0.399（表3），因此该方法的敏感性大于1:200。

2.6 重复性试验批内重复性试验：将6份GPV血清（阳性血清3份，阴性血清3份）用同一批包被的酶标板检测，重复3孔，计算同一批次3次重复的变异系数。结果表明试验中变异系数最大值约为4.5%，最小值约为1.7%（表4）。批间重复性试验：取不同时间包被的ELISA板，分别进行3次试验，计算3个不同批次间的变异系数。结果表明该方法的批间变异系数最大值约为9.5%，最小值约为3.0%（表4）。

表1 棋盘法确定NS1蛋白最佳包被浓度和血清稀释度Table 1 The optimization of NS1 protein coating concentration and serum dilution by checkerboard titration

表2 间接ELISA方法的特异性试验结果Table 2 Specif city test of the indirect ELISA

表3 间接ELISA方法的敏感性试验结果Table 3 Sensitivity test of the indirect ELISA

表4 间接ELISA方法的重复性试验结果Table 4 Repetition test of the indirect ELISA based on NS1 protein

2.7 间接ELISA方法的临床应用用建立的ELISA方法检测本实验室采集的种番鸭群抗GPV阳性血清样品88份，OD490值≥0.399时判定为阳性。测得免疫后番鸭群血清阳性样品81份，阳性率为92.0%。

3 讨论

鹅细小病毒主要侵害雏鹅和雏番鸭，其死亡率随日龄增长而下降[1]。由于该病发病日龄早，因此免疫种禽使幼雏获得母源抗体以抵抗病毒感染是目前常用的手段。尽管如此，小鹅瘟仍然时有发生，这可能与目前免疫覆盖率不足以及母源抗体降低等因素有关，因此监测弱毒疫苗免疫后母源抗体的水平显得尤为重要。Wang等[7]建立了基于GPV的VP3和NS1蛋白的Western blot检测方法，并将所检测的田间血清分为4组。结果显示，除无反应组外，其余3组均与NS1蛋白存在免疫反应，所检测的抗体阳性率为94.7%。这说明NS1蛋白的抗体是感染GPV后最早出现的，且持续时间长，因此其抗体比较适合用于抗体检测。

目前，基于GPV NS蛋白和VP3蛋白建立的相关检测方法较多。Zhang等[10]用pET30a（+）成功表达了GPV的VP3蛋白，用重组蛋白包被ELISA反应板后，临床样本检测结果表明该方法与病毒中和试验方法符合率在87%以上。尚绪增等[6]建立针对NS2蛋白的间接ELISA方法，与琼脂扩散试验结果的阳性符合率为100%。与病毒中和和琼脂扩散相比，ELISA方法最大的优势就是适合大规模样品的检测，尤其是NS蛋白与琼脂扩散试验结果符合率较高。本研究建立的ELISA方法特异性强，与MPV、DEV、DHV、NDV和RA的阳性血清均无交叉反应；重复性好，批内和批间重复试验的变异系数分别小于5%和10%；临床应用前景广，番鸭阳性血清样品检出率为92%。该方法可以为鹅细小病毒的血清学诊断和流行病学监测提供有力保障。

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DEVELOPMENT OF AN INDIRECT ELISA ASSAY USING PROKARYOTICALLY EXPRESSED NS1 PROTEIN OF GOOSE PARVOVIRUS

SUN Min-hua, DONG Jia-wen, LI Lin-lin, YUAN Jian-feng, KUANG Rui-huan, HU Qi-lin, ZHANG Jian-feng
(Guangdong Open Laboratory of Public Health, Institute of Animal Health, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, China)

The NS1 gene of GPV Foshan-2009 was amplif ed in PCR and cloned into pET32a(+) vector. The recombinant NS1 protein was expressed with induction of IPTG and analyzed in SDS-PAGE and Western blot. The expressed NS1 protein reacted well with the positive Muscovy duck serum against GPV. Then, an indirect ELISA assay was developed using the recombinant NS12 protein. The assay factors were determined using the Checkboard method, including coating NS1 protein at 0.5 μg/well, test serum dilution at 1:50 and conjugated antibody HRP dilution at 1:10 000. The assay was optimized with a cut-off value of 0.399. The cross testing demonstrated that the indirect ELISA had no reaction with positive sera against Muscovy duck parvovirus, Dnck virus, Dnck hepatitis virus, Newcastle disease virus andRiemerella anatipestifer.The intra- and inter-coeffcients of variabilities were 5% and 10%, respectively, suggesting its reproducibility and repeatability. Clinical testing showed that 92% positive rate was obtained with f eld samples. In conclusion, this indirect ELISA could be used for serological detection and surveillance of Goose parvovirus.

Goose parvovirus; NS1 protein; ELISA

S858.332.659.2

A

1674-6422（2014）06-0001-05

2014-08-05

公益性行业（农业）科研专项（201003012）；广东省科技计划项目（2012B050500013，2011B050700007）

孙敏华，男，助理研究员，主要从事禽病病毒学研究

胡奇林，E-mail：hql562713@163.com；张建峰，E-mail：zhang-jianfeng@139.com