蛋鸭坦布苏病毒与金黄色葡萄球菌混合感染的诊治

李志杰，提金凤,2，李 舫，杨明彩

（1. 山东畜牧兽医职业学院，潍坊 261061；2. 山东农业大学，泰安 261000）

蛋鸭坦布苏病毒与金黄色葡萄球菌混合感染的诊治

李志杰1，提金凤1,2，李 舫1，杨明彩1

（1. 山东畜牧兽医职业学院，潍坊 261061；2. 山东农业大学，泰安 261000）

山东省某养鸭场蛋鸭发病，通过临床诊断及实验室检测最终确诊为坦布苏病毒与金黄色葡萄球菌混合感染。通过对感染鸭群进行对症治疗和抗生素治疗，控制住了病情，减少了经济损失。

坦布苏病毒；金黄色葡萄球菌；蛋鸭；诊治

2010年4月以来，我国福建省、浙江省、江苏省、广西壮族自治区、山东省、安徽省、河北省、河南省等地相继出现蛋鸭产蛋率下降的病例，与新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）、禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）感染后的临床特点非常相似，但采用针对这两种病毒的控制方法来控制疫情均无效，给养鸭业造成了巨大的经济损失。通过各高校院所的禽病专家学者的一致努力，最终确定了该病的病原是一种黄病毒，即坦布苏病毒（Duck tembusu virus，TMUV），2011年中国畜牧兽医学会第一届水禽疫病防控研讨会将该病名称统一定为“鸭坦布苏病毒病”[1-3]。

坦布苏病毒属于黄病毒科、黄病毒属、蚊媒病毒类的恩塔亚病毒群。该病毒是20世纪 70 年代在马来西亚首次从库蚊体内分离到并命名，但有关病毒的致病性及所感染宿主的范围尚未确定。2000年前后，在对马来西亚实兆远地区某肉鸡养殖场中爆发的肉鸡瘫痪的病例调查过程中，分离到了一株TMUV分离株并将其命名为实兆远病毒（Sitiawan virus，SV），这是首次确定TMUV对禽类有致病性[4]。到目前为止，已经确定鸭坦布苏病毒能感染蛋鸭、种鸭、雏鸭、鸡、鹅、鸽子、麻雀等禽类[5,6]。

本研究通过对山东省聊城市某养鸭场的发病蛋鸭进行临床诊断与实验室检测，最终确定了鸭群不仅感染了鸭坦布苏病毒，还混合感染了金黄色葡萄球菌，并根据诊断结果对鸭群进行了治疗，治疗效果良好，为鸭场降低了经济损失。

1 材料与方法

1.1 病例山东省聊城市某养鸭场共养殖8000只蛋鸭，26周龄前后开始出现产蛋率骤降的情况。

1.2 主要试剂Trizol购自北京全仕金公司；dNTP反转录、TaqDNA聚合、DNAMarker（DL2000）购自大连宝生物工程有限公司。

1.3 主要试验材料9～11日龄鸭胚、匀浆器、注射器、普通营养琼脂培养基、鲜血培养基。

1.4 临床诊断观察发病鸭群临床症状，同时进行剖检。

1.5 病毒的分离鉴定取病死鸭的病变卵泡膜，经常规处理后，尿囊腔接种9～11日龄的SPF鸡胚，0.2mL/只，接种后的鸡胚放在37℃温箱中继续培养。弃掉24h以内死亡的鸡胚，保留24h后死亡的鸡胚，同时收集死亡鸡胚的尿囊液。观察死亡鸡胚的病变特点。对收集的尿囊液分别进行鸭坦布苏病毒、新城疫病毒和低致病性禽流感病毒常规RT-PCR检测。根据GenBank发布的鸭坦布苏病毒的基因序列，通过比对后依据NS1的保守基因序列设计引物：P1：5′-CTTTGGGTTTGGAGTGTTG-3′，P2：5′-CTTGTATCCTGTCCTCGTGTT-3′。将扩增的片段与pMD18-T载体连接后克隆至DH5α，送上海英潍捷基生物有限公司进行测序。

新城疫病毒和低致病性禽流感病毒的检测引物均依据国标进行设计，由上海英潍捷基生物有限公司合成。

1.6 细菌涂片镜检无菌取病死鸭的关节液以及肿大的肝脏、脾脏分别进行涂片，革兰氏染色后进行镜检。

1.7 细菌分离鉴定无菌取病死鸭的关节液及肿大的肝脏、脾脏，分别在普通培养基、鲜血琼脂上进行分区划线，37℃温箱中培养18～24h，观察菌落的形态。将长出的单个菌落进行涂片，革兰氏染色后，显微镜镜检。

1.8 细菌生化试验及RT-PCR鉴定将获得的单个细菌菌落用肉汤培养基37℃进行增菌培养，取0.3mL肉汤培养物与0.5mL凝固酶试验兔血浆于试管内充分混合，置37℃温箱中培养，定时观察是否有凝块形成，至少观察6h，以内容物完全凝固、试管倒置或倾斜时不流动者为阳性。

参照文献中已经发表的金黄色葡萄球菌16s rRNA基因的保守序列设计引物，以培养的菌株的基因组作为模板进行RT-PCR[7,8]。将扩增的片段与pMD18-T载体连接后克隆至DH5α，送上海英潍捷基生物有限公司进行测序。

2 结果与讨论

2.1 临床诊断结果通过观察，病鸭特征性症状主要表现为：精神沉郁、食欲下降，产蛋率在5 d内从80%逐渐下降至30%左右；有的病鸭在发病后期出现站立不稳、倒地震颤、歪脖、瘫痪、转圈等神经症状，有的病鸭跗跖关节高度肿胀，肿胀部位呈现淡紫色（图1）；个别病鸭最终出现衰竭死亡。

病死鸭的剖检病变主要表现为：卵泡充血、出血、萎缩，甚至破裂，形成卵黄性腹膜炎（图2）；有的病死鸭脑膜水肿、充血、出血等，有的病死鸭肝脏、脾脏极度肿大、色淡；对于病死鸭的肿胀关节进行剖检发现，关节腔中的关节液增多、粘稠，有的关节液呈现淡紫红色。

图2 病死鸭卵泡充血、出血、萎缩Fig.2 Follicular hyperemia, hemorrhage, atrophy in diseased ducks

根据蛋鸭的发病情况、临床症状及剖检病变进行初步诊断，该鸭群疑似混合感染了坦布苏病毒和金黄色葡萄球菌。

2.2 病毒的分离鉴定将常规处理后的病变卵泡膜接种鸡胚后，鸡胚在3～5 d内死亡，死亡鸡胚的尿囊膜增厚，胚体头部、颈部出血，肝脏出血、有白色坏死点。

利用设计的鸭TMUV引物，对收集的死亡鸡胚的尿囊液通过常规RT-PCR方法进行检测，扩增出大小为312 bp的目的片段（图3）。将获得的片段送至上海英潍捷基生物有限公司进行测序，测序结果进行Blast，与鸭TMUV NS1基因序列完全相符。用NDV和AIV的特异性引物进行检测，均没有扩增出目的片段（结果未显示）。

图3 鸡胚尿囊液TMUV NS1片段扩增结果Fig.3 Amplif cation of TMUV NS1 gene in allantoic f uid

2.3 细菌涂片镜检及分离鉴定无菌取病死鸭的关节液及肿大的肝脏、脾脏分别进行涂片，革兰氏染色，然后进行镜检。显微镜下均能观察到蓝紫色、圆形的小球菌，无其他形态的细菌出现。

无菌取病死鸭的关节液及肿大的肝脏、脾脏，利用普通培养基和鲜血琼脂进行细菌的分离培养。结果显示，普通培养基和鲜血琼脂上均长出了灰白色、圆形、光滑湿润的大菌落，普通培养基的菌落在室温下作用一定时间后颜色变成金黄色，鲜血琼脂上的菌落周围有溶血环。

将长出的单个菌落进行涂片，革兰氏染色后，显微镜镜检，能观察到成串的蓝紫色、圆形小球菌（图4），根据以上结果初步鉴定为金黄色葡萄球菌感染。

图4 病鸭体内金黄色葡萄球菌的分离与鉴定Fig.4 Isolation and identif cation of Staphylococcus in diseased ducks

2.4 细菌生化试验及RT-PCR鉴定利用获得的细菌的肉汤培养物进行血浆凝固酶试验，反应6 h后内容物完全凝固，进一步证实为金黄色葡萄球菌感染。

采用金黄色葡萄球菌16s rRNA特异性引物进行PCR扩增，在450 bp左右处扩增出了目的片段（图5）。

图5 细菌16s rRNA 扩增片段Fig.5 Amplif cation of Staphylococcus 16s rRNA

将扩增得到的片段送至上海英潍捷基生物有限公司进行测序，测序结果进行Blast，与金黄色葡萄球菌16s rRNA基因序列完全相符。

2.5 治疗措施对于鸭群感染坦布苏病毒，目前没有特异的治疗方法，只能采用对症治疗。首先将发病鸭隔离饲养，清洁鸭舍及周围的运动场，保持鸭舍的干燥通风。每天早晚用百毒杀、过氧乙酸或新吉尔灭等对鸭舍、料槽、水槽、运动场及周围环境等进行消毒，至少保持1周。其次，建议发病鸭群饮用黄芪多糖、双黄连等抗病毒中药。通过药敏试验选择对金黄色葡萄球菌敏感的药物，如环丙沙星、氨苄青霉素等。同时给鸭群补充电解多维、Vc等，提高机体的抵抗力。对于尚未发病的鸭群可以采用预防剂量的抗病毒中药及复合抗生素饮水，同时在饮水中添加电解多维等，防止发病。

采取以上措施后，病鸭的食欲、饮水、精神等明显好转，产蛋率也逐渐恢复，没有再出现新发病例。

2.6 鸭坦布苏病毒病是近几年出现的新病，自从2010年在我国首次爆发以来，迅速席卷了我国绝大多数养鸭地区，几乎所有蛋种鸭场都未能幸免，部分地区的商品鸭发病也很严重。该病主要造成产蛋种鸭产蛋率严重下降，且恢复缓慢，一般需要1～2个月，后期死淘率上升；商品鸭发病后主要表现为颤栗、歪颈、瘫痪等神经症状，死亡率升高，一般在10%～30%左右，严重的甚至高达80%，给我国养鸭业造成了巨大的经济损失[9,10]。对于该病的传染源、传播途径或感染方式以及公共卫生学等方面尚未有定论，目前关于该病的很多研究还在进行中。

由于鸭坦布苏病毒病与新城疫、禽流感的临床症状及病变非常相似，因此该病最早在鸭群中出现时被误诊为禽流感、新城疫，由于防治措施不对症，给养鸭业造成了巨大的损失。该病最早是通过实验室检测确诊。现在关于坦布苏病毒感染的实验室检测方法也陆续建立起来了，如LAMP法、ELISA法、巢式PCR法等。本研究通过PCR等实验室检测方法有效鉴定了疫情，并给与了及时治疗，有效控制了疫情，避免了巨大经济损失。

[1] Cao Z , Zhang C, Liu Y,et al.Tembusu virus in ducks, China[J]. Emerg Infect Dis, 2011, 17(10): 1873-1875.

[2] Su J, Li S, Hu X,et al.Duck egg-drop syndrome caused by BYD virus, a new Tembusu-related flavivirus[J]. PloS one, 2011, 6(3): e18106.

[3] Yan P, Zhao Y, Zhang X,et al.An infectious disease of ducks caused by a newly emerged Tembusu virus strain in mainland China[J]. Virology, 2011, 417(1): 1-8.

[4] Kono Y, Tsukamoto K, Abd Hamid M,et al.Encephalitis and retarded growth of chicks caused by Sitiawan virus, a new isolate belonging to the genus Flavivirus[J]. Am J Trop Med Hyg, 2000, 63(1-2): 94-101.

[5] Tang Y, Diao Y, Yu C,et al.Characterization of a Tembusu virus isolated from naturally infected house sparrows (Passer domesticus) in Northern China [J]. Transbound Emerg Dis, 2013, 60(2), 152-158.

[6] Tang Y, Diao Y, Gao X,et al.Analysis of the complete genome of Tembusu virus, a flavivirus isolated from ducks in China[J]. Transbound Emerg Dis, 2012, 59(4), 336-343..

[7] 邓海平, 蒲万霞, 梁剑平, 等. 牛源金黄色葡萄球菌16s rRNA分子鉴定与随机多态性扩增分型[J].中国兽医杂志, 2011, 47(4): 9-12.

[8] 邓海平, 蒲万霞, 梁剑平 ,等. 贵州地区牛源金黄色葡萄球菌分离株16s rRNA分子鉴定与RAPD分型研究[J]. 中国畜牧兽医, 2011, 38(1): 112-115.

[9] Yu K, Sheng Z Z, Huang B,et al.Structural, antigenic, and evolutionary characterizations of the envelope protein of newly emerging Duck Tembusu Virus[J]. PloS one, 2013, 8(8): e71319.

[10] Yun T, Zhang D, Ma X ,et al.Complete genome sequence of a novel flavivirus, duck tembusu virus, isolated from ducks and geese in China[J]. J Virol, 2012, 86(6), 3406-3407.

DIAGNOSIS AND TREATMENT OF MIXED INFECTION OF TEMBUSU VIRUS AND STAPHYLOCOCCUS IN LAYER DUCKS

LI Zhi-jie1, TI Jin-feng1,2, LI Fang1, YANG Ming-cai1
(1. Shandong Animal Science and Veterinary Vocational College, Weifang 261061, China; 2. Shandong Agricultural University, Taiˊan 261000, China)

A disease broke out in layer ducks on a farm in Shandong province, which was later diagnosed as a mixed infection of Tembusu virus and staphylococcus according to clinical signs and laboratory testing. The diseased ducks received symptomatic treatment and antibiotic therapy and gradually got back to health. The economic losses of affected duck farms were reduced due to prompt diagnosis and treatment.

Tembusu virus;Staphylococcus; layer ducks; infection

S852.659.6

B

1674-6422（2014）06-0077-04

2014-08-11

山东省现代农业产业技术体系家禽创新团队建设项目（家禽疫病防控岗位SDAIT-13-011-05）；国家级星火计划项目（2011GA740033）；潍坊市科学技术发展计划（2013YD139）

李志杰，男，讲师，主要从事家禽疾病防治及研发工作

李舫，女，E-mail：sdmylifang@163.com