巨型艾美耳球虫早熟株免疫剂量研究

赵其平，朱顺海，韩红玉，李 莎，翟 颀，梁思婷.2，杨斯涵.3，黄 兵,4，董 辉

（1.中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物寄生虫学重点实验室，上海 200241；2.上海师范大学生命与环境科学学院，上海 200234；3.云南农业大学动物科学技术学院，昆明 650201；4.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州 225009）

巨型艾美耳球虫早熟株免疫剂量研究

赵其平1，朱顺海1，韩红玉1，李 莎1，翟 颀1，梁思婷1.2，杨斯涵1.3，黄 兵1,4，董 辉1

（1.中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物寄生虫学重点实验室，上海 200241；2.上海师范大学生命与环境科学学院，上海 200234；3.云南农业大学动物科学技术学院，昆明 650201；4.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州 225009）

为了确定巨型艾美耳球虫（Eimeria maxima）早熟株合适的免疫剂量，本文设立7个早熟株免疫攻虫组、7个母株免疫攻虫组、1个不免疫攻虫组和1个不免疫不攻虫组，7个早熟株/母株免疫组的免疫剂量为孢子化卵囊100、200、400、600、800、1000和2000个/羽，经嗉囊感染，7日龄首次免疫，14日龄以同等剂量进行第二次免疫，21日龄以8×104个/羽的同源母株进行攻虫，28日龄结束试验，以增重、肠道病变记分和卵囊减少率为试验指标。对早熟株中免疫保护效果较好的2个免疫剂量进行重复试验，免疫方法、试验周期、试验指标和攻虫剂量同第一批试验。结果显示：早熟株和母株200、400、600、800、1000、2000个/羽免疫组攻虫后的增重与健康对照组差异不显著（P＞0.05），100个/羽免疫组明显低于健康对照组（P＜0.05）；各免疫组的卵囊减少率均达90%以上，肠道病变记分均与不免疫攻虫组差异不显著（P＞0.05）。用早熟株200、400个/羽进行免疫重复试验，两个免疫组攻虫期间的增重和肠道病变记分均与健康对照组差异不显著（P＞0.05），而与不免疫攻虫组差异显著（P＜0.05），其卵囊减少率均在86%以上。研究结果表明，该巨型艾美耳球虫早熟株保持了良好的免疫原性，每只鸡免疫200或400个孢子化卵囊均可诱发鸡产生良好的免疫保护力，可考虑以200个孢子化卵囊作为该早熟株在疫苗制备中的推荐免疫剂量。

球虫；巨型艾美耳球虫；早熟株；免疫

鸡球虫病是由艾美耳属（Eimeria）球虫引起的一种普遍存在的原虫病，能引起鸡生长发育停滞，饲料报酬降低，甚至死亡，对全球养鸡业每年造成大约20亿英镑损失[1]。长期以来，抗球虫药是预防和控制球虫病的主要方法，但药物无节制的使用导致球虫抗药性的大量产生。另一方面，政府和消费者希望药物添加剂能逐步被淘汰[2]。幸运的是，用球虫活疫苗来代替药物已经被证明是可行的方法，目前欧盟约80%的鸡群是通过使用商品化球虫活疫苗来免疫预防球虫病[3,4]。

巨型艾美耳球虫（E. maxima）对鸡致病力中等，主要寄生于鸡小肠中段，具有分布较广，危害大，免疫原性最强等特点[5]。在中国，巨型艾美耳球虫是肉鸡养殖中最常见的3种球虫之一，也是球虫活疫苗常包含的虫种之一[6]。前期研究中，我们已获得一株巨型艾美耳球虫早熟株。该早熟株致病力比母株弱，免疫原性与母株相当，遗传稳定性好，对7种常见抗球虫药物敏感[7,8]，可用于球虫弱毒活疫苗的研制。本文拟研究该早熟株不同免疫剂量的保护效果，为确定推荐免疫剂量和制备球虫活疫苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 二黄鸡，购自上海市某郊区孵化场，出壳后立即运回本所试验动物房饲料。在无球虫的环境下喂养，试验前连续2 d检查粪便，确认无球虫感染。

1.1.2 虫株 巨型艾美耳球虫（E. maxima）上海株（资源号CAAS 2111301），由黄兵等[9]于1995年用单卵囊分离技术分离于上海市郊区某大型鸡场，潜在期142 h；巨型艾美耳球虫早熟株（资源号CAAS 2111314），由中国农业科学院上海兽医研究所诱导获得，潜在期107 h[7]。两个虫株孢子化卵囊置于2.5%的重铬酸钾溶液中4℃保存，试验前经鸡体传代获得新鲜卵囊后备用。

1.2 方法

1.2.1 第一批试验 将480只6日龄雏鸡逐只称重，按每组30只鸡随机分为16组，调整各组体重基本相同。7日龄进行首免，其中第1组～第7组用早熟株免疫，免疫剂量分别为每只鸡100、200、400、600、800、1000及2000个孢子化卵囊；第8组～第14组用母株免疫，免疫剂量与早熟株相同。第15组为阳性对照组（不免疫攻虫组），第16组为空白对照组（不免疫不攻虫组）。14日龄进行二免，各组免疫剂量与首免相同。二免后d7称重，除第16组外，各组分别用母株进行攻虫，剂量为每只鸡8×104个孢子化卵囊。攻虫后4～7 d，每天收集粪便称重，用麦氏虫卵计数法计每克粪便卵囊数（OPG），统计各组平均每只鸡的卵囊排出总量，计算卵囊减少率。28日龄结束试验，逐只称重、处死，取小肠进行肠道病变记分，并计算21～28日龄期间（攻虫期间）的增重。试验期间观察记录各组鸡的精神、食欲、饮水、发病、死亡及粪便状况。

1.2.2 第二批试验 根据第一批试验结果，对获得的两个免疫效果较好的剂量进行重复试验。取120只鸡称重，按每组30只鸡随机分为4组，调整各组体重基本相同。第1组和第2组选取第一批试验免疫效果较好的两个剂量，第3组为不免疫攻虫组，第4组为不免疫不攻虫组。7日龄首免，14日龄二免，21日龄称重后，除了第4组外，其余各组每只鸡接种母株8×104个孢子化卵囊。攻虫后处理措施、试验周期等与第一批试验相同。

1.2.3 观测指标 用3项指标综合判断：①病变记分，参照Johnson和Reid方法[10]，依据肠道病变程度分别记为0～4分；②相对增重率，以攻虫后7d间各组的增重占不免疫不攻虫组增重的百分率。相对增重率＝（各组平均增重÷不免疫不攻虫组平均增重）×100%；③卵囊减少率，以各组平均每只鸡在攻虫后4～7 d排出卵囊量计算卵囊减少率。卵囊减少率＝（不免疫攻虫组排出卵囊总量－免疫攻虫组排出卵囊总量）÷不免疫攻虫组排出卵囊总量×100%。

1.2.4 数据处理 采用SPSS 11.5统计软件对各组的增重及病变记分进行方差分析，其中，P＜0.05为差异显著。

2 结果

2.1 第一批试验巨型艾美耳球虫早熟株免疫剂量初步试验结果见表1。由表可知，从增重方面看，各免疫组的增重均明显高于不免疫攻虫组（P＜0.05）；免疫剂量为200、400、600、800、1000、2000个/羽组增重与健康对照组相当（P＞0.05），而剂量为100个/羽组的增重明显低于健康组（P＜0.05）。在肠道病变记分方面，各免疫组出现轻微病变，均与不免疫攻虫组差异不显著（P＞0.05）。在卵囊减少率方面，各免疫组仅有少量卵囊排出，卵囊减少率为95.86%～99.88%。综合增重、肠道病变记分、卵囊减少率等指标分析，拟将200和400个/羽作为巨型艾美耳球虫早熟株的推荐免疫剂量，进行第二批试验。

表1 巨型艾美耳球虫早熟株不同免疫剂量的保护效力Table 1 The effectiveness of precocious line of Eimeria maxima with different immune dosages

巨型艾美耳球虫母株免疫剂量初步试验结果见表2。由表可知，从增重方面看，剂量为100个/羽组的增重稍高于不免疫攻虫组，但差异不显著（P＞0.05），其余各免疫组的增重均明显高于不免疫攻虫组（P＜0.05）；剂量为100个/羽组的增重明显低于健康对照组（P＜0.05），其余各免疫组的增重均与健康对照组差异不显著（P＞0.05），其中200和400个/羽组的增重最好。在肠道病变记分方面，各免疫组出现轻微病变，均与不免疫攻虫组差异不显著（P＜0.05）。在卵囊减少率方面，各免疫组仅有少量卵囊排出，卵囊减少率为93.46%～98.83%。

2.2 第二批试验巨型艾美耳球虫早熟株免疫剂量200、400个／羽的重复试验结果见表3。由表可知，两个免疫组的增重与健康对照组差异不显著（P＞0.05），均明显高于不免疫攻虫组（P＜0.05）。在肠道病变记分方面，两个免疫组出现轻微病变，病变记分与健康对照组的差异不显著（P＞0.05），均明显低于感染对照组（P＜0.05）。在卵囊产量方面，免疫组的卵囊减少率为86.49%和87.91%。结果表明，200、400个/羽巨型艾美耳球虫早熟株均可获得较好的免疫保护力，把200个/羽作为推荐免疫剂量。

表2 巨型艾美耳球虫母株不同免疫剂量的保护效力Table 2 The effectiveness of parent strain of Eimeria maxima with different immune dosages

表3 巨型艾美耳球虫早熟株不同免疫剂量重复试验保护效力Table 3 The effectiveness of precocious line of Eimeria maxima with different immune dosages(Repeated)

3 讨论

球虫进入鸡体后，不仅刺激机体产生免疫保护力，也对鸡体造成不同程度的损伤。所以，一种良好的球虫活疫苗，不仅需要疫苗虫株具有良好的免疫原性，而且疫苗中各种类球虫卵囊的数量和比例需要搭配科学、合理，在免疫原性和致病性之间找到一个平衡，既能刺激机体产生良好的免疫保护力，又不会出现明显的致病力，产生严重的疫苗反应，影响鸡只生长发育、甚至爆发球虫病。但是由于鸡球虫种类繁多、变异虫株多、生活史复杂，不同种抗原具有特异性、同种不同株之间抗原存在差异、甚至同株不同发育阶段的虫体抗原成分也不尽相同，所以，每个虫株的合适的免疫剂量不尽相同，需要通过试验筛选。

目前，球虫合适的免疫剂量还没有统一的判定标准，不同的研究者采用不同的判定指标。华绍桂等[11]以成活率、费用、料重比、均重、饲料指数等5项指标，Long等[12]以增重和病变记分等2项指标。在前期试验中，本实验室选用增重、病变记分和卵囊减少率等3项指标作为判定指标对柔嫩艾美耳球虫早熟株[13]和堆型艾美耳球虫早熟株[14]的免疫剂量进行了研究。本试验以母株作为对照，选用相同的指标对巨型艾美耳球虫早熟株的免疫剂量进行研究。结果显示，该早熟株的免疫原性与同等剂量的母株的相当，具有良好的免疫原性，这与McDonald等[15]、Shirley等[16]、王江清等[17]、董辉等[7]的结果一致。在自然感染中，巨型艾美耳球虫生活史的无性阶段，尤其是第2代裂殖生殖阶段，是诱导保护性免疫最重要的阶段，而有性生殖阶段几乎没有免疫原性[18]。与母株相比，巨型艾美耳球虫早熟株的生活史中缺失了最后的1或2代裂殖生殖[19]，因而不影响其免疫原性。

试验结果表明，用巨型艾美耳球虫早熟株与母株免疫雏鸡后都能产生一定的保护力，攻虫后二者的指标规律性基本一致。攻虫后，早熟株和母株免疫组均仅有少量卵囊排出，卵囊减少率都超过90%以上；均出现的轻微肠道病变，但与不免疫攻虫组差异不显著（P＞0.05），原因可能是攻虫剂量偏低，不免疫对照组仅出现轻微的病变记分（+1分）；比较二者增重，发现200～2000个/羽的增重均与健康对照组相当（P＞0.05），而100个/羽组的增重均明显低于健康对照组（P＜0.05），这可能是100个/羽免疫剂量过小，不能使鸡产生足够的基础免疫力。在200～2000个/羽免疫组中，2000个/羽免疫组的增重稍低于其他免疫组，原因可能是2000个/羽对免疫鸡具有较强的致病作用，导致肠上皮细胞大量损伤而难以在短时间内恢复，影响饲料的转化率和增重。以上结果上说明，200～1000个/羽均可获得良好的免疫保护力。选择200和400个/羽进行了重复试验，综合增重、病变记分和卵囊减少率三个判定指标，结果显示，两个免疫组均可获得良好的免疫效果。

考虑到一个好的疫苗应具有低剂量免疫、保护效果好、成本低等因素，建议将200个/羽作为巨型艾美耳球虫早熟株的推荐免疫剂。该剂量也与已有研究基本一致。Rose[20]研究发现单次接种250个巨型艾美耳球虫卵囊就能获得较强的免疫保护力。樊生超等[21]分别选用巨型艾美耳球虫早熟株（P12株）200、500、800、1000个卵囊/羽一次性免疫鸡，发现200个卵囊/羽为其最小有效免疫剂量。陶建平等[22]选用11株巨型艾美耳球虫，每个虫株免疫剂量为100个/羽，一次性灌服免疫鸡，同源攻虫试验中均获得较强的临床免疫力。国外商品化球虫弱毒疫苗Paracox®含两株巨型艾美耳球虫早熟株，每头份疫苗中含200个巨型艾美耳球虫CP株和100个巨型艾美耳球虫MFP株。

本文考察了实验室诱导的巨型艾美耳球虫早熟株不同免疫剂量的保护效果，初步拟定了制作疫苗的推荐免疫剂量，为研制球虫疫苗奠定了基础。

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STUDY ON THE IMMUNIZING DOSAGES OF A PRECOCIOUS LINE OF EIMERIA MAXIMA

ZHAO Qi-ping1, ZHU Shun-hai1, HAN Hong-yu1, LI Sha1, ZHAI Qi1, LIANG Si-ting1,2, YANG Si-han1,3,HUANG Bing1,4, DONG Hui1
(1. Key Laboratory of Animal Parasitology of the Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2. College of Life and Environment Sciences, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China; 3. College of Animal Science and Technology, Yunan Agricultural University, Kunming 650201, China; 4. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China)

In order to determine optimal immunization dose of a precocious line ofEimeria maxima,the first trial was conducted including 7 groups immunized with a precocious line, 7 groups immunized with its parent strain, 1 unimmunized-challenged group and 1 unimmunized-unchallenged group. Dosages of 100, 200, 400, 600, 800, 1000 and 2000 sporulated oocysts of the precocious line or its parent strain were administered orally to 7-day-old chickens for twice at a 7-day interval. Seven days later, all chickens in the challenged grorps were challenged with 8×104sporulated oocysts of the parent strain. Weight gains, intestinal lesion scores and reduction of oocystratios were used to evaluate the efficacy. Weight gains of immunization groups with 200-2000 sporulated oocysts of the precocious line and parent strain had no significant difference from those of unimmunized-unchallenged group (P＞0.05) while weigh gains of immunization groups with 100 sporulated oocysts were signif cantly lower than those of unimmunized-unchallenged group (P ＜ 0.05). Oocyst production were reduced over 90% in all immunization groups. Intestinal lesion scores of all immunization groups were similar to those of unimmunized-challenged group (P ＞ 0.05). The effectiveness of doses of 200 and 400 sporulated oocysts of precocious line were repeated. Both weight gains and intestinal lesion scores of these two immunization groups were similar to those of unimmunizedunchallenged group (P ＞ 0.05), but signif cantly different from those of unimmunized-challenged group (P ＜ 0.05). Reduction of oocysts ratios was over 86%. Results from both trials demonstrated that the precocious line of E. maxima maintains good immunogenicity and could induce suff cient immunological protection at 200/400 immunizing dosage. Therefore, 200 sporulated oocysts were determined to be optimal immunization dose.

Coccidia;Eimeria maxima;precocious line; immunization

S852.723

A

1674-6422（2014）06-0032-06

2014-06-13

上海市科委重点科技攻关项目（12391902200）

赵其平，男，兽医师，主要从事球虫保种技术与球虫病防治研究

董辉，E-mail：donghui@shvri.ac.cn