日本血吸虫四跨膜孤儿受体（TOR）克隆及其第一个膜外区基因的表达

马 帅，韩艳辉，洪 炀，张 旻，曹晓丹，韩 倩，刘艳涛，陆 看，马茜茜，陆 珂，贾秉光，林矫矫,2，傅志强

（1. 中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物寄生虫学重点开放实验室，上海 200241；2. 江苏省动物重要疾病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州 225009）

日本血吸虫四跨膜孤儿受体（TOR）克隆及其第一个膜外区基因的表达

马 帅1，韩艳辉1，洪 炀1，张 旻1，曹晓丹1，韩 倩1，刘艳涛1，陆 看1，马茜茜1，陆 珂1，贾秉光1，林矫矫1,2，傅志强1

（1. 中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物寄生虫学重点开放实验室，上海 200241；2. 江苏省动物重要疾病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州 225009）

埃及血吸虫和曼氏血吸虫四跨膜孤儿受体（trispanning orphan receptors, TOR）受体可以结合补体C2a，可能在血吸虫免疫逃避过程中起重要作用。为研究日本血吸虫TOR受体的特性和功能，利用PCR扩增到SjTOR基因并进行了生物信息学分析；同时克隆了SjTOR基因N端第一个膜外区（ed1）基因，构建了重组质粒pET-28a-SjTOR-ed1，在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达后用组蛋白亲和层析纯化获得重组蛋白SjTOR-ed1，Western blot结果显示rSjTOR-ed1能被日本血吸虫阳性小鼠血清识别。该研究为进一步开展研究日本血吸虫TOR受体的功能提供了基础。

日本血吸虫；四跨膜孤儿受体；生物信息学；基因克隆；Western blot

血吸虫病（schistosomiasis）是由血吸虫尾蚴感染人或哺乳动物而引起的一种慢性消耗性人畜共患寄生虫病，在包括亚州、非州、拉丁美洲等的76个国家或地区流行，我国南方地区流行的是日本血吸虫病，严重危害社会、经济发展[1]。对受感染的人和家畜采用吡喹酮进行药物治疗是血吸虫病防控中控制传染源常用的技术手段，然而药物治疗并不能预防或阻止该病的再感染[2]。因此通过研发抗血吸虫疫苗，利用其免疫预防的长期效果辅助药物治疗的完全有效但短期的作用，是血吸虫防治技术的重要研究方向。

血吸虫尾蚴钻过终末宿主的皮肤，经历复杂的移行过程发育为成虫在哺乳动物的下腔静脉系中长期寄生。血吸虫在宿主体内的发育及其长期寄生生活和其强大的逃避宿主免疫攻击的能力是密切相关的。血吸虫体被与宿主直接接触，其相关物质可能在免疫逃避中起重要作用[3]。因此，分离鉴定这些和免疫逃避相关的分子，研究其功能对了解血吸虫免疫逃避机理及疫苗研究有重要帮助。

血吸虫四跨膜孤儿受体（trispanning orphan receptors, TOR）蛋白是一种血吸虫体被表面抗原受体[4]，在埃及、曼氏血吸虫的研究中发现，其作为表面受体可以结合补体C2a，由此推测其可能通过抑制补体激活途径，而在血吸虫免疫逃避过程中起重要作用。日本血吸虫TOR蛋白的研究未见报道。刘峰等[5]在对不同发育时期日本血吸虫体被表膜蛋白进行蛋白组学分析时，在多个时期分离到了TOR蛋白，本实验室在前期的日本血吸虫体被表膜蛋白质组研究中也曾分离鉴定到TOR蛋白。本研究克隆了日本血吸虫TOR基因，表达了其主要功能区—N端第一个膜外区（ed1）基因，用Western blot检测了重组蛋白（rSjTOR-ed1）的抗原性，为深入研究SjTOR的生物学功能提供了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 Trizol和superscripTMII反转录酶为Invitrogen公司产品；ExTaqHot Start DNA聚合酶、小量质粒提取试剂盒、质粒pMD19-T、限制性内切酶XhoI、EcoR I、T4 DNA连接酶等购自TaKaRa生物工程(大连)有限公司；QIAquick Gel Extraction Kit购自Qiagen公司；Agarose、DEPC等购自上海生工生物工程公司；DNA Marker DM2000、DM5000购自上海天根生物科技有限公司；硝酸纤维素膜（Whatman）购自北京经科宏达生物技术有限公司；Bacto-yeast extract、Bacto-trypton为Oxoid 公司产品；Ni-NTA His. Bind Resin（Merck-Novagen）购自中科新生命生物科技有限公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）购自上海鼎国生物工程公司；DAB显色试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.2 菌种、实验动物和血清 原核表达载体pET-28a (+)由上海兽医研究所农业部动物寄生虫学重点实验室保存；感受态大肠杆菌（E.coli）DH5α、BL21（DE3）购自天根生化科技（北京）有限公司；日本血吸虫中国大陆株尾蚴由中国农业科学院上海兽医研究所钉螺室提供；新西兰白兔（雄性，2.5～3.0 kg）购自上海罗泾飞达实验动物养殖场；6周龄雄性（SPF级）BALB/c小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司；将新西兰白兔以腹部贴片法感染尾蚴2000条，感染42 d后剖杀，以肝门静脉灌注法收集虫体，用PBS充分洗涤去除粘附的宿主组织后，冻存于液氮备用。日本血吸虫42 d阳性血清是将小鼠感染42 d后眼球采血获得。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取及反转录PCR 取保存在液氮中的42 d日本血吸虫虫体，按Trizol试剂盒说明书进行总RNA提取及纯化，按照TaKaRa反转录试剂盒说明书进行反转录试验，产物保存于－80℃备用。

1.2.2 SjTOR基因扩增及生物信息学分析 根据日本血吸虫四跨膜孤儿受体基因（GI:56756944）序列，利用Primer Premier 5.0软件分析并设计引物，并以1.2.1制备的日本血吸虫42 d成虫cDNA为模板，扩增SjTOR ORF的DNA片段。上下游引物分别：5'-GCGGAATTCATGCCACGAGCTTCT-3'，5'-CGCCTCGAGTTAGCAAGGATGAAC-3'（下划线部分分别表示EcoR I和Xho I限制性内切酶识别位点），引物由上海华津生物技术有限公司合成。PCR程序：94℃预变性5 min，热循环参数为94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃终延伸1 min共30个循环，72℃延伸15 min，10℃保存。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，用DNA凝胶回收试剂盒进行纯化回收，再克隆至载体pMD19-T中并转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞。将转化后的大肠杆菌接种于含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，挑选单个菌落扩大培养，提取质粒进行双酶切鉴定，阳性质粒送上海华津生物技术有限公司测序。

将测序得到的DNA序列用BLAST进行同源性比对；用Clustal X软件对其相应的氨基酸序列进行多重比对；利用DNAStar对其氨基酸组成、序列、蛋白质相对分子质量和等电点等参数进行预测分析；利用SignalP 4.0预测分析其信号肽信息；利用NetNGlyc 1.0（www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc）预测分析肽段的糖基化位点；利用GOR IV（http://gor.bb.iastate.edu/）和PSIPRED（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）程序预测分析其二级结构和跨膜结构。

1.2.3 SjTOR-ed1片段扩增及重组质粒pET-28a-SjTOR-ed1的构建 根据1.2.2的跨膜结构预测分析结果和曼氏血吸虫四跨膜孤儿受体SmTOR的跨膜分析结果，SjTOR的N端第47～168位可能为第一个膜外区SjTOR-ed1，利用Primer Premier 5.0软件设计引物，并以日本血吸虫42 d成虫cDNA为模板，扩增与SjTOR-ed1肽段相对应的DNA片段。上下游引物分别：5'-GCGGAATTCATGACGTTTAATCCG-3'，5'-CGCCTCGAGTCAAATGTATG GACT-3'（下划线部分分别表示EcoRI和XhoI限制性内切酶识别位点），引物由上海华津生物技术有限公司合成。PCR反应条件与1.2.2中所述相似。PCR产物经DNA凝胶回收试剂盒进行纯化回收后，用EcoR I和XhoI双酶切克隆至表达载体pET-28a(+)中构建重组表达质粒pET-28a-SjTOR-ed1，并转化入大肠杆菌DH5α，挑取单个菌落扩大培养，提取质粒送上海华津生物技术有限公司测序。将测序正确的重组质粒纯化后保存于－20℃。

1.2.4 重组蛋白rSjTOR-ed1在大肠杆菌中的表达及纯化 将纯化的重组表达质粒pET-28a-SjTOR-ed1转入BL21（DE3）感受态细胞中，以PCR鉴定为阳性的克隆（pET-28a-SjTOR-ed1/BL21）接种于LB液体培养基，37℃震荡培养，当菌液OD600=1.0时加入终浓度为1 mmol/L的IPTG进行诱导表达。在IPTG诱导后的不同时间点分别收集菌液，以SDS-PAGE电泳分析经超声裂解后的菌体蛋白，判断重组蛋白的表达状况，确定相关诱导表达条件及最佳诱导时间。用8 mol/L尿素溶解以包涵体形式存在的重组蛋白，利用Ni-NTA His、Bind Resin层析柱进行分离纯化，随后以含6、4、2.1 mol/L尿素的PBS及PBS逐步透析复性。

1.2.5 重组蛋白rSjTOR-ed1的抗原性分析 将2 μg复性的重组蛋白进行Western blot分析其抗原性，具体将rSjTOR-ed1进行SDS-PAGE电泳后，经低温电转移至硝酸纤维素（NC）膜上，用42 d小鼠日本血吸虫阳性血清作一抗室温温育1 h，正常小鼠血清作阴性对照，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG（IgG-HRP）为二抗室温温育2 h，用二氨基联苯胺（DAB）进行显色，水洗终止反应，观察有无特异性条带出现并拍照保存结果。

2 结果

2.1 SjTOR、SjTOR-ed1片段扩增及重组质粒pET-28a-SjTOR-ed1的构建以日本血吸虫42 d cDNA为模板，利用特异性引物进行PCR扩增得到大小依次为1245、357 bp的DNA片段（图1A），与预期大小相符。将该片段纯化回收，利用EcoR I和XhoI限制性内切酶克隆入载体pET-28a (+)，构建pET-28a-SjTOR-ed1重组表达质粒，经过酶切鉴定和测序证实重组准确（图1B）。

2.2 SjTOR基因生物信息学分析分析结果显示，SjTOR基因编码414个氨基酸残基，其中强碱性氨基酸31个、强酸性氨基酸30个、疏水性氨基酸142个、极性氨基酸146个，理论分子量为46479.17 Da，理论等电点为7.59。与参考序列（Q5DC12）相比有一个氨基酸差异（第130位氨基酸，由K突变为E）。SjTOR与SmTOR（C4QM85）、ShTOR（Q9BLM6）及TcCRIT（Q5J7P3）的氨基酸相似性分别为77.0%、72.0%、75.0%（图2）。SignalP预测未发现信号肽，NetNGlyc分析显示该序列可能有5个糖基化位点，分别位于第305、362、372、377、393位氨基酸。氨基酸二级结构预测显示，该多肽以α螺旋、无规则卷曲和延伸链为主（图3），含有4个跨膜结构，与SmTOR、ShCTIR相似，比ShTOR多一个跨膜结果（图2）。

图1 SjTOR基因克隆和SjTOR-ed1片段克隆及其重组质粒鉴定Fig.1 Cloning of SjTOR gene and SjTOR-ed1 fragment (A) and identif cation of the recombinant plasmid pET-28a-SjTOR-ed1 by EcoR I and Xho I digestion (B)

图2 TOR基因氨基酸序列的同源性分析Fig.2 Clustal X alignment of the amino acid sequences of TOR

图3 蛋白的二级结构预测Fig.3 Prediction of the secondary structure of SjTOR protein

2.3 重组蛋白rSjTOR-ed1在大肠杆菌中的表达及纯化将重组表达质粒pET-28a-SjTOR-ed1转化大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导后在14.5 kDa处可见特异的重组蛋白分子，并且诱导时间与该蛋白的表达量呈正比，诱导5 h后表达量较高（图4）。回收菌体蛋白进行溶解试验，结果表明重组蛋白以包涵体形式存在，但可溶解于8 mol/L尿素溶液中。在变性条件下经过Ni-NTA His·Bind Resin 树脂纯化后，可以获得较纯的重组蛋白（图5）。而后将纯化的重组蛋白用含不同浓度梯度尿素/PBS溶液透析复性，最后用PBS透析，可得到复性的重组蛋白rSjTOR-ed1。

图4 SDS-PAGE分析重组蛋白rSjTOR-ed1时相表达量Fig.4 SDS-PAGE analysis of rSjTOR-ed1 protein at different expression time points

图5 SDS-PAGE分析纯化的重组蛋白rSjTOR-ed1Fig.5 SDS-PAGE analysis of purif ed rSjTOR-ed1

2.4 重组蛋白rSjTOR-ed1的抗原性分析应用重组蛋白rSjTOR-ed1进行的Western blot分析结果显示，小鼠阴性血清不能识别，可以被小鼠日本血吸虫阳性血清识别（图6），表明其具有良好的抗原性。

图6 重组蛋白rSjTOR-ed1的Western blot分析Fig.6 Western blot analysis of recombinant rSjTOR-ed1 protein

3 讨论

血吸虫尾蚴突破皮肤屏障后即可受到宿主免疫应答的攻击，补体反应是宿主最早开始杀伤虫体的免疫应答[6,7]。但是血吸虫在长期的进化过程中也积累了应对宿主补体系统的能力，血吸虫在尾蚴阶段对血清补体是非常敏感的，但在尾蚴转变为童虫2～4 h后对血清补体杀伤的敏感性就开始逐渐下降[8]，这表明血吸虫在感染早期就对宿主的补体反应有抑制或调节作用，这种转变可能和血吸虫膜结构变化和体被表膜上的分子有关[9,10]。

TOR分子，又称CRIT（complement C2 receptor inhibitor trispanning），首先在埃及血吸虫、曼氏血吸虫中鉴定得到[4]，后发现广泛分布在包括从早期的硬骨鳕鱼到大鼠和人类多种生物[11]。对人CRIT分子的特性和功能研究表明，CRIT分子和C4b分子具有相似的补体C2结合位点，可与C2补体结合阻止C3转化酶形成，从而阻断补体级联反应[11-14]。Hui等[15]研究发现CRIT也可通过其ed1的一段多肽CRIT-H17阻断D因子介导的B因子的裂解从而干扰补体替代途径的激活。关于血吸虫TOR分子的研究报道仅见于埃及血吸虫和曼氏血吸虫，对日本血吸虫TOR分子的研究尚未展开。本研究克隆了SjTOR基因全长序列并进行了分析，结果显示该序列不含有信号肽且与SmTOR相似性最高，都具有4个跨膜区，其中第一个膜外区ed1含有和C4b相似的保守位点[16]。因此，推测SjTOR分子可能具有抑制和调节宿主补体反应的功能，并在移行发育过程中发挥重要的免疫逃避功能。

Lochmatter等[17]应用重组SmTOR-ed1在两次独立的小鼠曼氏血吸虫病免疫保护试验中分别诱导了64%和45%的减虫率，结果表明SmTOR-ed1重组蛋白是一个有潜力的血吸虫疫苗候选抗原分子。本文首次克隆了日本血吸虫TOR基因，分析发现其具有保守的补体分子C2结合位点，在大肠杆菌BL21（DE3）中表达纯化获得的重组蛋白rSjTOR-ed1具有较好的抗原性。该结果为后续评估其作为候选疫苗分子潜力、开展其表达特性及生物学功能研究提供了基础。

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CLONING OF TRISPANNING ORPHAN RECEPTOR OF SCHISTOSOMA JAPONICUM AND EXPRESSION OF ITS FIRST EXTRACELLUAR DOMAIN

MA Shuai, HAN Yan-hui, HONG Yang, ZHANG Min, CAO Xiao-dan, HAN Qian, LIU Yan-tao, LU Kan, MA Qian-qian, LU Ke, JIA Bing-guang, LIN Jiao-jiao, FU Zhi-qiang
(1. Key Laboratory of Animal Parasitology of the Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China)

Trispanning orphan receptors ofSchistosoma haematobium(ShTOR) andS. mansoni(SmTOR) can bind to complement C2a, which may play an important role in immune evasion ofSchistosoma.To characterize functions ofSchistosoma japonicumtetraspanning orphan receptor (SjTOR), entire SjTOR ORF was amplified in PCR and its sequence was analyzed in bioinformatics. Moreover, the N-terminal extracellular domain 1 (ed1) of the SjTOR gene was subcloned into vector pET-28a (+) to construct a recombinant plasmid pET-28a-SjTOR-ed1. The recombinant rSjTOR-ed1 was expressed inEscherichiacoli BL21 (DE3) and purif ed using a Ni-NTA His·Bind Resin. Western blot analysis showed that rSjTOR-ed1 reacted with schisosomasis-positive mouse serum. The results from the present study were useful to characterize functions of SjTOR in future study.

Schistosoma japonicum;trispanning orphan receptor; bioinformatics; cloning; Western blot

S852.735

A

1674-6422（2014）06-0046-07

2014-08-05

国家自然科学基金资助项目(31472188）; 上海市科技发展基金(12140902700)

马帅，男，硕士研究生，预防兽医学专业

傅志强， E-mail：fuzhiqiang@shvri.ac.cn