三七皂苷 Rb1对 局 部脑缺血 后 大鼠海马 CA1区脑血流 及 GLT-1 的影响

安 冬， 罗海芸， 王时云， 罗耀辉， 钱忠义， 吴兰鸥*

（1.昆明医科大学基础医学院药理学系， 云南 昆明 650500； 2.昆明医科大学机能中心， 云南 昆明650500； 3.昆明医科大学基础医学院病理与病理生理学系， 云南 昆明 650500）

［科研报道］

三七皂苷 Rb1对 局 部脑缺血 后 大鼠海马 CA1区脑血流 及 GLT-1 的影响

安 冬1， 罗海芸1， 王时云1， 罗耀辉2， 钱忠义3， 吴兰鸥1*

（1.昆明医科大学基础医学院药理学系， 云南 昆明 650500； 2.昆明医科大学机能中心， 云南 昆明650500； 3.昆明医科大学基础医学院病理与病理生理学系， 云南 昆明 650500）

目的 探讨三七皂苷 Rb1对局部脑缺血后大鼠海马 CA1区脑血流 （rCBF） 及神经胶质谷氨酸转运体 （GLT-1）的影响。 方法 雄性 SD大鼠48 只， 随机分为脑缺血假手术组、 模型组、 三七皂苷 Rb1、 尼莫地平治疗组， 每组6 只，制成局灶性脑缺血模型， 各组于缺血后 4 h 腹腔给药， 假手术组、 模型组给予生理盐水； 缺血后 24 h 测海马 CA1区rCBF水平； 测定 GLT-1 的表达， 观测对比上述指标变化。 结果 与模型组相比， 三七皂苷 Rb1、 尼莫地平治疗组均能增加局部 rCBF（P＜0.05）， 并能上调大鼠海马 CA1区 GLT-1 的表达 （P＜0.05）。 结论 三七皂苷 Rb1能增加 rCBF，还能上调 GLT-1 的表达， 发挥对神经元损伤所起的保护作用， 为进一步研发三七皂苷 Rb1在治疗缺血性脑疾患上提供实验依据。

三七皂苷 Rb1； 局灶性脑缺血； 海马 CA1区； 脑血流； 神经胶质谷氨酸转运体； 大鼠

脑缺血是以脑循环血流量减少为特征的脑血管疾病，发病率占脑卒中的 70% ～80%， 并且具有高致残、 高致死的特点［1］。 我国拥有大量的中草药资源， 而中草药又具有副作用小，价格便宜的优点。中药及其单体的药理作用研究是近几年心血管药理研究的热点方向之一。研究发现，三七总皂苷及其主要成分 Rg1、 Rb1等对脑缺血有一定的保护作用［2］。 目前对三七皂苷 Rg1的研究很多， 但是对三七皂苷 Rb1的研究甚少， 而且机制尚不明确。 本实验从三七皂苷 Rb1对脑缺血后大鼠局 部 脑 血 流 （ regional cerebral blood flow， rCBF） 及 神经 胶 质 谷 氨 酸 转 运 体 （ glial glutamate transporter 1， GLT-1） 的影 响 方 面 入 手， 研 究 三 七 皂苷 Rb1在脑缺血中的作用， 旨在为三七系列产品治疗中枢神经系统疾患，特别是缺血性脑疾患提供科学的实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 健康成年 SD大鼠 48 只， 雄性， 体质量260 ～320 g， 由昆明医科大学实验动物中心提供， 动物合格证号： SCXK （ 滇） 2011-0004。 随机分为假手术组、 模型组、 缺血后给三七皂苷 Rb1高、 中、 低剂量组以及缺血后给尼莫地平高、中、低剂量组，各组动物均为6只。

1.2 药品配制与主要试剂 三七皂苷 Rb1单体由昆明制药厂提供， 为白色粉末状 （纯度 ＞98.57%）， 按最大剂量组100mg/kg计算， 需配 2 g/100mL， 中剂量组对半稀释， 低剂量组再取中剂量组对半稀释；尼莫地平注射液为德国拜耳公司 生 产， 规格 为 0.2 mg/mL； GLT-1 一 抗 由 Millipore公司生产， 100 μg浓缩型， 按 1 ∶100 稀释； 二抗 pv-6000通用型二步法免疫组化试剂盒，由北京中杉金桥生物技术有限公司生产； DAB显色剂： DAB-0031， 由福州迈新生物技术开发有限公司生产。

1.3 主要器材 大鼠脑立体定位仪 68000 型； PeriFlux System 5000 型激光多普勒 （LD） 血流测定仪； 采图显微镜为Leica DM4000B高级显 微 镜； HPIAS-1000 高 清 晰 度 病 理 图文分析系统。

1.4 大鼠局灶性脑缺血模型的制备及给药 采用电凝闭大脑中动脉致局灶性脑缺血模型［3］， 加以改进， 大鼠以 3%戊巴比妥钠 （10 mg/kg） 腹腔注射麻醉， 制成右侧大脑中动脉脑缺血模型 （MCAO）。 缺血4 h 后， 按不同给药剂量（均腹腔注射， 注射量均为 5 mL/kg）， 随机分为 MCAO假手术组 （只手术， 不阻断大脑中动脉， 给生理盐水， 10 mg/kg）； MCAO模型组 （给生理盐水， 10 mg/kg）； MCAO三七皂苷 Rb1高剂量组 （100 mg/kg）； MCAO三七皂苷Rb1中剂量组 （50 mg/kg）； MCAO三七皂苷 Rb1低剂量组（25 mg/kg）； MCAO 尼 莫 地 平 高 剂 量 组 （ 1 mg/kg）；MCAO尼莫地平中剂量组 （0.5 mg/kg）； MCAO尼莫地平低剂量组 （0.25 mg/kg）。

1.5 大鼠海马 rCBF的测定 各组大鼠完成实验过程后，于术后 24 h， 用 3%的戊巴比妥钠麻醉后， 使用脑立体定位仪固定动物， 以人字缝为基准， 人字点前 （4 mm）、 中线右侧 （3 mm） 坐标处为穿刺点， 钻开颅骨 （1 mm2）；自硬脑膜表面向下垂直推进4 mm至海马，植入激光多普勒 血 流 仪 探 头， 连 续 监 测 rCBF （ 采 用 PeriFlux System 5000 型 LD血流测定仪和接触式探头及 Perimed 公司提供的 Perisoft配套软件进行曲线输出记录） 。 血流仪将采集 信号转 换 成 血 流 灌 注 单 位 （ perfusion unit， PU） =CMBC（一定体积内细胞的分布率） ×V（平均血细胞的移动速率）［4］。

1.6 免疫组化染色法 动物 rCBF测量后， 麻醉 断头取脑， 并石蜡包埋脑组织于海马处连续切片 （4 μm）， 采用 MaxVision 快 捷 法， 阳 性 细 胞 胞 浆 呈 棕 黄 色， 测 定 阳性细胞平均灰度值表示 GLT-1 阳性信号的相对强弱。 石蜡切片脱蜡、梯度乙醇脱水后，浸泡于蒸馏水中待用；对组织进行高压抗原修复； 3%H2O2阻断内源性过氧化物酶， PBS （pH7.4） 冲洗 3 次； 非免疫小牛血清封闭10 min， 甩去血清， 不冲洗； 用 PBS 冲洗 3 次， 每 次 3 min； 除去 PBS 液， 加一抗 4 ℃冰箱下孵育过夜； PBS冲洗 3 次， 每次 3 min； 除 去 PBS 液， 加 二 抗， 室 温 下孵育 15 min； PBS 冲洗 3 次， 每次 3 min； 除去 PBS 液，每张切片加50 μL新鲜配制的 DAB溶液， 显微镜下观察3 ～5 m in； 自来水 冲洗， 切片经梯度乙醇脱 水干燥， 二甲苯透明， 中性树胶封固。 阴性对照用 PBS 代替一抗，其余步骤同上。

1.7 图像分析 每张脑片选取海马 CA1区5 个视野， 用高倍镜 （ ×40） 下 HPIAS-1000 高清晰度病理图文分析系统摄像、 分析， 半定量测定 GLT-1 阳性表达的动态变化， 以阳性细胞平均灰度值表示 GLT-1 阳性信号的相对强弱 （仅计算该视野细胞的平均灰度值）， 平均灰度值越低则表明染色越深，表达越强。

2 结果

2.1 三七皂苷 Rb1对 MCAO后大鼠海马 CA1区 rCBF的影响 结果见表 1。 与假手术组比较， 模型组 rCBF显著减少， 差异有 统 计 学 意 义 （ P＜0.05） ； 三 七 皂 苷 Rb1高、中、 低剂量组与模型组比较差异均有显著性 （P＜0.05），尼莫地平高、中、低剂量组与模型组比较差异均有显著性（P＜0.05）； 三七皂苷 Rb1中、 低剂量组与高剂量组相比差异显著 （P＜0.05）， 尼莫地平中、 低剂量组与高剂量组相比差异显著 （P＜0.05）； 三七皂苷 Rb1高剂量组与尼莫地平高剂量组相比差异显著 （P＜0.05）。

表 1 三七皂苷 Rb1对 MCAO后大鼠海马 CA1区 rCBF的影响 （， n=6）

表 1 三七皂苷 Rb1对 MCAO后大鼠海马 CA1区 rCBF的影响 （， n=6）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

脑血流值局灶性脑缺血假手术组 - 107.3 ±4.3组 别 剂量/（mg·kg-1）△局灶性脑缺血模型组 - 50.7 ±2.6*缺血后给三七皂苷 Rb1高剂量治疗组 100 88.6 ±2.5*△缺血后给三七皂苷 Rb1中剂量治疗组 50 75.0 ±1.2*△缺血后给三七皂苷 Rb1低剂量治疗组 25 69.0 ±1.8*△缺血后给尼莫地平高剂量治疗组 1 93.2 ±2.8*△缺血后给尼莫地平中剂量治疗组 0.5 84.3 ±1.7*△缺血后给尼莫地平低剂量治疗组 0.25 72.1 ±2.0*△

2.2 三七皂苷 Rb1对 MCAO后大鼠海马 CA1区 GLT-1 的影响 结果见表2。 缺血模型组相对假手术组表达增多 （P＜0.05）； 三七皂苷 Rb1高、 中剂量组与模型组比较差异均有显著性 （P＜0.05）， 尼莫地平高、 中剂量组与模型组比较差异均有显著性 （P＜0.05）； 三七皂苷 Rb1中、 低剂量组与高剂量组相比差异显著 （P＜0.05）， 尼莫地平中、 低剂量组与高剂量组相比差异显著 （P＜0.05）； 三七皂苷 Rb1高剂量组与尼莫地平高剂量组相比无显著差异 （P＞0.05）。 研究结果如图 1 所示， GLT-1 阳性表达呈棕黄色， 表达于海马 CA1区神经元细胞胞浆。 在正常脑组织海马 CA1区神经元少有 GLT-1 表达， 胞浆DAB染色呈弱阳性， 灰度值较高， 发生脑缺血后治疗组与缺血模型组比较， GLT-1 表达明显增高， 染色呈阳性，GLT-1 灰度值均降低。 假手术组大鼠海马 CA1区 GLT-1 阳性细胞数量较少，锥体细胞排列整齐，细胞形态完整，胞核较大（图1A）； 模型组大鼠海马 CA1区可见锥体细胞排列稀疏， 细胞间隙增宽，个别锥体细胞水肿变形或细胞体积缩小等现象（图1B）； 低剂量三七皂苷 Rb1组， 大鼠海马 CA1区细胞形态与模型组基本一致，但出现个别锥体细胞水肿变形、阳性细胞数目增多等现象 （图1F）； 中剂量三七皂苷 Rb1组与低剂量三七皂苷 Rb1组基本一致， 阳性细胞数目较低剂量增多 （图1G）； 高剂量三七皂苷 Rb1组与中剂量三七皂苷 Rb1组基本一致，但出现个别锥体细胞水肿变形等现象，阳性细胞数目较中剂量增多 （图1H）； 阳性对照组， 高剂量尼莫地平组大鼠海马 CA1区细胞形态与高剂量三七皂苷 Rb1组基本一致， 也出现个别锥体细胞水肿变形等现象，阳性细胞数目与高剂量三七皂苷 Rb1组相当 （图1E）。

表 2 三七皂苷 Rb1对 MCAO后大鼠海 马 CA1区 GLT-1表达的影响 （， n=6）

表 2 三七皂苷 Rb1对 MCAO后大鼠海 马 CA1区 GLT-1表达的影响 （， n=6）

注： 与假手术组比较，*P＜0.05， 与模型组比较，△P＜0.05

度值局灶性脑缺血假手术组 - 131.5 ±4.8组 别 剂量/（mg·kg-1）平均灰△局灶性脑缺血模型组 - 124.2 ±5.0*缺血后给三七皂苷 Rb1高剂量治疗组 100 85.2 ±3.5*△缺血后给三七皂苷 Rb1中剂量治疗组 50 109.0 ±6.2*△缺血后给三七皂苷 Rb1低剂量治疗组 25 123.3 ±6.8*缺血后给尼莫地平高剂量治疗组 1 89.8 ±3.7*△缺血后给尼莫地平中剂量治疗组 0.5 115.2 ±8.4*△缺血后给尼莫地平低剂量治疗组 0.25 122.9 ±6.9*

图 1 各组大鼠脑部切片海马 CA1区 GLT-1 的免疫组化染色照片 （免疫组化染色 ×400）

3 讨论

脑血管疾病的发生伴随脑异常微环境的产生［5］。 脑微环境是脑细胞间质及其中的体液成分参与构成的脑细胞生存的微环境，微环境成分的异常变化可使脑细胞发生病变［6］。 脑微环境的变化是一个互动联系的过程， 在脑缺血时，由于构成神经元微环境各因素间的相互作用，导致微环境损坏的放大， 形成异常微环境［7］。 脑缺血时海马微环境内兴奋性氨基酸-谷氨酸增多， 以致离子在细胞内外分布发生紊乱［8］。 有研究表明， 当脑缺血时， 伴随着星形胶质细胞的活化，谷氨酸的过量释放可造成神经元微环境的异常， 继而又进一步损伤神经元［9］。 因脑缺血的根本问题集中在 rCBF， 而海马微环境的正常与否， 取决于 rCBF的消长变化［10］。 由于 LD血流仪可精确、 直观地反映组织局部的缺血程度， 本研究应用该技术记录海马 CA1区 rCBF的动态变化， 研究三七皂苷 Rb1对改善 rCBF是否起作用。 本实验结果显示： 三七皂苷 Rb1高、 中、 低剂量和尼莫地平高、中、 低剂量均能改善局部缺血后大鼠海马 CA1区的脑血流量， 三七皂苷 Rb1高剂量作用显著， 尼莫地平高剂量作用显著。

谷氨酸 （ glutamate， Glu） 是中枢 神 经系统 （ CNS） 最主要的兴奋性神经递质， 对正常脑功能和 CNS 的发育发挥重要的调节作用［11］。 由于细胞外不存在谷氨酸代谢酶系统， 谷氨酸的清除主要依靠谷氨酸转运体的摄取［12］。 目前已发现 5 种高亲和性兴奋性氨基酸转运体 （EAATs）， 包括EAAT1 （ 又 称 为 GLAST）、 EAAT2 （ 又 称 为 GLT-1 ）、EAAT3、 EAAT4 和 EAAT5。 它们在脑内的分布特征不同，一般认为， GLAST和 GLT-1 为胶质细胞转运体， 主要分布在星形胶质细胞； EAAC1、 EAAT4 和 EAAT5 为神经细胞转运体［13］。 正常情况下， 胶质细胞的 GLT-1 对 Glu 的摄取转运能力较神经元强得多，是维持兴奋性氨基酸浓度的主要转运体［14］。 病理情况下， 谷氨酸转运体能力会下降或者中断， 引起突触间隙或胞外谷氨酸大量蓄积［15］。 因此， 本实验重在研究三七皂苷 Rb1对缺血后海马 GLT-1 的影响。 本实验结果显示： 三七皂苷 Rb1高、 中剂量和尼莫地平高、中剂量均能上调局部缺血后大鼠海马 CA1区 GLT-1 的表达，三七皂苷 Rb1高剂量在同组比较中平均灰度值最低， 可见其作用显著；尼莫地平高剂量在同组比较中平均灰度值最低，同样可见其作用显著，尼莫地平高剂量与三七皂苷Rb1高剂量相比无显著差异。

通过本次研究发现三七皂苷 Rb1能增加脑血流量， 还能上调 GLT-1 的表达， 其机制可能是通过改善突触间隙内谷氨酸的浓度，使其趋于正常，达到改善异常微环境的目的， 从而增加脑血流量， 再改善异常微环境， 上调 GLT-1的表达，形成循环，最终发挥对神经元损伤所起的保护作用，从而发挥其对脑缺血的治疗作用。这为进一步研发三七皂苷 Rb1在治疗缺血性脑疾患上提供了实验依据。

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R285.5

： B

： 1001-1528（2014）03-0605-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.035

2013-05-11

云南省教育厅研究生基金 （2011J035）； 云南省科技厅—昆明医科大学联合项目 （2013FZ054）

安 冬 （1988—） ， 女， 硕士生， 从事脑血管药物方面的研究。 Tel： 15198989229， E-mail： gogoandong@126.com

*通信作者： 吴兰鸥， 女， 硕士， 教授， 硕士生导师， 从事心脑血管药物方面的研究。 E-mail： lanouwu@126.com