正源方对60Co-γ射线致小鼠损伤的保护作用研究
2014-04-11曲永红王鹏远王晓娟唐志书唐俊琪
曲永红, 王鹏远, 王晓娟*, 唐志书, 唐俊琪
(1.陕西中医学院药学院,陕西 咸阳 712046; 2.第四军医大学口腔医院药剂科,陕西 西安 710032; 3.西安医学院,陕西 西安 710021)
正源方对60Co-γ射线致小鼠损伤的保护作用研究
曲永红1,2, 王鹏远2, 王晓娟2*, 唐志书1*, 唐俊琪3
(1.陕西中医学院药学院,陕西 咸阳 712046; 2.第四军医大学口腔医院药剂科,陕西 西安 710032; 3.西安医学院,陕西 西安 710021)
目的 研究正源方 (西洋参、 当归、 南沙参、 仙鹤草、 重楼) 对60Co-γ射线辐射致小鼠造血和生殖系统损伤的保护作用。方法 将小鼠随机分为正常组、模型组、皂矾丸组、正源方高、中、低剂量组。除正常组外其余组小鼠均接受 5.5 Gy60Co-γ射线全身照射。 观察各组小鼠白细胞、 血小板计数和体质量的变化, 实验结束后测定心、 肝、 脾、肺、肾、睾丸和精囊前列腺等脏器指数,在显微镜下观察脾脏和睾丸的病理变化。结果 与模型组比较,各给药组小鼠的外周血白细胞、 血小板计数及脾脏指数均显著上升 (P<0.05 或 P<0.01), 以正源方低剂量组上升最明显, 其中血小板提升效果优于阳性药复方皂矾丸 (P<0.01); 正源方各给药组辐射小鼠的睾丸和精囊前列腺指数均有显著提高 (P<0.01 或 P<0.05), 以低剂量组最明显, 而阳性对照药无该作用 (P>0.05), 脾脏和睾丸组织切片显示正源方低剂量组对辐射破坏的修复作用最好。 结论 正源方能够促进60Co-γ射线照射后小鼠外周血中白细胞、 血小板的恢复,脾脏中造血细胞的再生以及睾丸中生殖细胞的增殖,对小鼠的造血和生殖系统损伤有一定的保护作用。
正源方;辐射损伤;造血系统;生殖系统
正源方是临床经验方,处方由西洋参、当归、南沙参、仙鹤草、重楼五味中药组成,具有扶正解毒,止血生血之功效,用于多种辐射损伤引起的血小板减少,白细胞下降,毛发脱落,皮肤红斑、斑疹、 紫癜等症[1], 具有良好的疗效。 本实验通过观察正源方对60Co-γ射线辐射损伤小鼠外周血象、生殖器官的影响, 来探讨正源方对60Co-γ射线辐射损伤小鼠造血系统和生殖系统的保护作用,以期为进一步开发新的中药抗辐射防护剂提供实验依据。
1 材料
1.1 药物与试剂 西洋参、 当归、 南沙参、 仙鹤草、重楼饮片购于西安盛兴中药饮片有限责任公司。 药材加水浸泡 30 min 后, 煎煮 3 次, 过滤,合并滤液,浓缩,制成每毫升含 0.60 g生药的药液,置于4℃冰箱备用;复方皂矾丸,陕西郝其军制药股份有限公司, 批号为 20110209, 用生理盐水制成质量浓度为 0.084 g/mL的溶液, 置于 4 ℃冰箱备用; EDTA-K2(乙二胺四乙酸二钾) 真空采血管,成都瑞琦科技实业有限责任公司,批号为09030910; 0.9% 氯化钠注射液, 山东鲁抗辰欣药业有限公司, 批号为 1101299031; 水为实验室自制双蒸水。
1.2 仪器 电子天平 (TD10001A, 余姚市金诺天平仪器有限公司); 血细胞分析仪 (PE-6800, 深圳市普康电子有限公司); 分析天平 (BT125D, 北京赛多利斯科学仪器有限公司);石蜡切片机( RM2235, 德 国 Leica 公 司 ); 正 置 显 微 镜(DM6000B, 德国 Leica公司)。
1.3 动物 清洁级昆明种小鼠, 雄性, 6 ~8 周龄, 体质量 18 ~22 g, 购自中国人民解放军第四军医大学实验动物中心, 实验动物许可证号 SCXK(军) 2007-007。
2 方法
2.1 动物分组、模型制备、 给药与指标观察[2-4]清洁级昆明种小鼠 72只, 雄性, 随机分为 6组,每组12只: 正常组、 模型组、 皂矾丸组、 正源方高剂量组、正源方中剂量组、正源方低剂量组。其中,皂矾丸组用皂矾丸溶液灌胃 [1.68 g/(kg·d)], 正源方各组分别用正源方提取液灌胃 [高、 中、 低剂量分别为 12.00、 6.00、 3.00 g/(kg·d)], 各组小鼠按照 20 mL/kg体质量灌胃给药,正常组和模型组同时给予等体积的生理盐水灌胃。每天1次, 连续给药 33 d。 于第 10 天灌胃 1 h 后除正常组外,其余组小鼠在第四军医大学辐照中心均接受5.5 Gy60Co-γ射线全身照射。 各组均于照射后第 3天、 第 9 天、 第 17 天和第 23 天眼眶取血, 测血常规, 并于照射后第 23 天, 称小鼠体质量, 然后处死解剖取其脏器 (心、 肝、 脾、 肺、 肾、 睾丸和精囊前列腺), 称质量并计算脏器指数 (脏器指数 =脏器质量/体质量, 用 mg/g表示); 其中脾脏和睾丸做石蜡切片,HE染色, 并进行病理组织学镜检[5]。
2.2 统计学处 理 采用 SPSS 13.0 软 件对数据进行统计学处理, 实验数据以均数 ±标准差 ()表示。 两样本方差的比较用 F检验, 若方差齐,则组间比较采用t检验, 若方差不齐, 则组间比较采用近似 t检验,即 Cochran&Cox法检验,P<0.05 有统计学意义。
3 结果
3.1 正源方对60Co-γ射线照射后小鼠白细胞的影响 模型组小鼠在照射60Co-γ射线后的第 3 天、第9 天、 第17 天、 第23 天,白细胞计数比正常组显著降低 (P<0.01); 给药组小鼠 (皂矾丸组和正源方各剂量组) 在照射后的第17 天、 第23 天, 与模型组比较, 各组白细胞计数显著上升 (P<0.05或 P<0.01), 说明各给药组辐射小鼠的白细胞计数逐渐恢复上升,且正源方低剂量组的白细胞上升最大;正源方低剂量组白细胞计数与皂矾丸组比较, 无显著性差异 (P>0.05), 说明低剂量正源方在该指标疗效与阳性药皂矾丸无差异。见表1。
表 1 正源 方 对60Co-γ射线照 射 小鼠外周 血 白细胞计 数 的影响 (n=12,)Tab.1 Effect of Zhengyuan Prescription on the count of peripheralw hite blood cells of60Co-γray irradiated m ice( n=12,)
表 1 正源 方 对60Co-γ射线照 射 小鼠外周 血 白细胞计 数 的影响 (n=12,)Tab.1 Effect of Zhengyuan Prescription on the count of peripheralw hite blood cells of60Co-γray irradiated m ice( n=12,)
注: 与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01; 与皂矾丸组比较,▲P<0.05,▲▲P<0.01
造模后白细胞/( ×109·L-1)3 d 9 d 17 d 23 d正常组 — 3.85 ±0.55** 3.26 ±0.75** 3.45 ±0.64** 7.73 ±0.87组 别 剂量/(g·kg-1)**模型组 — 0.82 ±0.35 0.69 ±0.25 1.46 ±0.27 3.71 ±0.87皂矾丸组 1.68 0.74 ±0.14 0.80 ±0.39 2.32 ±0.70** 6.99 ±1.13**正源方高剂量组 12.00 0.60 ±0.27 0.42 ±0.18*▲ 2.07 ±0.69* 5.20 ±1.03**▲▲正源方中剂量组 6.00 0.68 ±0.19 0.37 ±0.06**▲▲ 1.98 ±0.32** 4.89 ±1.34*▲▲正源方低剂量组 3.00 0.84 ±0.35 0.68 ±0.16 2.35 ±0.79** 6.44 ±0.35**
3.2 正源方对60Co-γ射线照射后小鼠血小板的影响 模型组小鼠在照射60Co-γ射线后的第 3 天、第9 天、 第17 天、 第23 天, 血小板计数与正常组相比显著降低 (P<0.01 或 P<0.05); 正源方低剂量组小鼠在照射后第 9 天、 第 17 天、 第 23 天,血小板计数逐渐上升,均高于模型组,有显著性差异(P<0.05 或 P<0.01), 说明正源方低剂量组对辐射小鼠血小板计数有恢复作用;其中,正源方低剂量组小鼠在辐射后第23天, 血小板计数上升最高,且明显高于皂矾丸组 (P<0.01), 提示低剂量正源方能够显著提高辐射小鼠的血小板数量,且该指标疗效优于阳性对照药皂矾丸。 见表2。
表 2 正 源 方对60Co-γ射线照射 小 鼠外周血 血 小板计数 的 影响 (n=12,)Tab.2 Effect of Zhengyuan Prescription on the count of peripheral p latelets of60Co-γray irradiated m ice( n=12,)
表 2 正 源 方对60Co-γ射线照射 小 鼠外周血 血 小板计数 的 影响 (n=12,)Tab.2 Effect of Zhengyuan Prescription on the count of peripheral p latelets of60Co-γray irradiated m ice( n=12,)
注:与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01; 与皂矾丸组比较,▲P<0.05,▲▲P<0.01
组 别 剂量/(g·kg-1)造模后血小板/( ×109·L-1)3 d 9 d 17 d 23 d正常组 — 519.91 ±103.44* 575.00 ±113.31** 843.42 ±107.24** 852.33 ±171.89**模型组 — 404.17 ±107.63 287.58 ±57.24 413.75 ±102.00 567.33 ±141.10皂矾丸组 1.68 428.33 ±89.37 365.50 ±66.86* 560.08 ±118.07** 645.08 ±131.64正源方高剂量组 12.00 525.75 ±180.80 318.67 ±76.37 450.42 ±140.03 632.00 ±87.33正源方中剂量组 6.00 535.25 ±184.38 282.50 ±74.74▲ 438.33 ±137.09▲ 574.75 ±75.21正源方低剂量组 3.00 646.73 ±299.62*▲ 379.50 ±97.80* 611.33 ±144.51** 834.16 ±147.67**▲▲
3.3 正源方对60Co-γ射线照射后小鼠脏器指数的影响 除了脾脏指数,模型组和各给药组小鼠的心、肝、肺、肾脏器指数与正常组比较,无统计学意义 (P>0.05), 说明小鼠无论给药与否, 在照射60Co-γ射线后的第 23 天, 其心、 肝、 肺、 肾脏器并无实质性损伤;但模型组小鼠的脾脏指数显著低于正常组 (P<0.05), 说明辐射能对小鼠脾脏造成损伤;相对模型组,各给药组小鼠的脾脏指数均明显升高 (P<0.05 或 P<0.01), 其中,正源方低剂量组小鼠的脾脏指数上升最大,提示正源方低剂量组对小鼠的脾脏有显著保护作用。见表3。
表 3 正源方对60Co-γ射线 照 射小鼠心 、 肝、 脾 、 肺、 肾指数影 响 (n=12,)Tab.3 Effect of Zhengyuan Prescription on hear t, liver, sp leen, lung and kidney indexes of60Co-γray irrad iated m ice(n=12,)
表 3 正源方对60Co-γ射线 照 射小鼠心 、 肝、 脾 、 肺、 肾指数影 响 (n=12,)Tab.3 Effect of Zhengyuan Prescription on hear t, liver, sp leen, lung and kidney indexes of60Co-γray irrad iated m ice(n=12,)
注: 与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01
组 别 剂量/(g·kg-1)心脏指数/(mg·g-1)肝脏指数/(mg·g-1)脾脏指数/(mg·g-1)肺脏指数/(mg·g-1)肾脏指数/(mg·g-1)正常组 — 2.65 ±0.49 27.31 ±3.27 1.82 ±0.50*2.92 ±0.32 7.43 ±0.94模型组 — 2.54 ±0.34 27.11 ±3.81 1.43 ±0.30 2.96 ±0.53 7.31 ±1.14皂矾丸组 1.68 2.69 ±0.51 27.65 ±3.17 1.75 ±0.32* 2.91 ±0.30 7.43 ±1.16正源方高剂量组 12.00 2.59 ±0.27 26.07 ±1.63 1.68 ±0.26* 3.09 ±0.30 6.87 ±0.92正源方中剂量组 6.00 2.56 ±0.21 27.42 ±3.38 1.75 ±0.32* 2.92 ±0.31 7.15 ±0.86正源方低剂量组 3.00 2.49 ±0.31 25.96 ±2.56 1.83 ±0.29**2.90 ±0.22 7.20 ±0.95
3.4 正源方对60Co-γ射线照射后小鼠睾丸、 精囊前列腺指数的影响 模型组小鼠的睾丸指数和精囊前列腺指数显著低于正常组 (P<0.01 或 P<0.05), 说明辐射对小鼠的生殖系统造成损伤;而皂矾丸组的睾丸指数和精囊前列腺指数与模型组比较没有统计学差异 (P>0.05), 说明皂矾丸组不能完全拮抗辐射致小鼠生殖系统的损伤;与模型组比较,正源方低剂量组的睾丸指数和精囊前列腺指数都有显著上升 (P<0.01 或 P<0.05),提示正源方低剂量组对生殖系统损伤有一定的保护作用。见表4。
表 4 正源方对60Co-γ射线 照 射小鼠睾 丸 、 精囊 前 列腺指数 影 响 (n=12,)Tab.4 Effect of Zhengyuan Prescription on testis and sem inal vesicle prostate indexes of60Co-γray irradiated m ice( n=12,)
表 4 正源方对60Co-γ射线 照 射小鼠睾 丸 、 精囊 前 列腺指数 影 响 (n=12,)Tab.4 Effect of Zhengyuan Prescription on testis and sem inal vesicle prostate indexes of60Co-γray irradiated m ice( n=12,)
注: 与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01
组 别 剂量/(g·kg-1)睾丸指数/(mg·g-1)精囊前列腺指数/(mg·g-1)正常组 — 3.21 ±0.39** 2.93 ±0.73*模型组 — 1.36 ±0.22 2.16 ±0.46皂矾丸组 1.68 1.52 ±0.27 2.62 ±0.66正源方高剂量组 12.00 1.39 ±0.31 2.00 ±0.32正源方中剂量组 6.00 1.30 ±0.26 2.05 ±0.35正源方低剂量组 3.00 2.93 ±0.36** 2.63 ±0.58*
3.5 正源方对60Co-γ射线照射后小鼠体质量的影响 正常组小鼠生长较快,体质量增长最大,模型组小鼠体质量增长最小,且与正常组相比有显著性差异 (P<0.01);与模型组比较, 给药组中仅正源方低剂量组的小鼠体质量增长最大,有显著性差异 (P<0.05), 提示正源方低剂量组有促进辐射损伤小鼠体质量增长的作用。 见表5。
表 5 正 源方对60Co-γ射线照 射 小鼠体质 量 的影响 (n=12,)Tab.5 Effect of Zhengyuan Prescription on body weigh t of60Co-γray irradiated m ice(n=12,)
表 5 正 源方对60Co-γ射线照 射 小鼠体质 量 的影响 (n=12,)Tab.5 Effect of Zhengyuan Prescription on body weigh t of60Co-γray irradiated m ice(n=12,)
注: 与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01
/g正常组 — 19.65 ±1.74 38.80 ±2.07 19.15 ±2.23组 别 剂量 /(g·kg-1) 初始体质量/g 终末体质量/g 体质量变化值**模型组 — 20.13 ±1.40 31.92 ±3.58 11.78 ±4.53皂矾丸组 1.68 20.68 ±0.81 33.37 ±2.59 12.69 ±2.91正源方高剂量组 12.00 21.68 ±0.97 36.60 ±1.57 14.93 ±4.30正源方中剂量组 6.00 21.02 ±1.33 33.41 ±2.55 12.39 ±2.92正源方低剂量组 3.00 20.91 ±1.11 37.02 ±2.20 16.11 ±2.45*
3.6 正源方对60Co-γ射线照射后小鼠脏器病理切片的影响
3.6.1 正源方对60Co-γ射线照射后小鼠脾脏的影响 正常小鼠脾脏组织切片HE染色后在显微镜下可见少量造血细胞,辐射损伤小鼠由于造血组织在不同程度上受到破坏或抑制,脾脏内残存的部分造血干细胞、祖细胞可出现代偿性增生;辐射小鼠脾脏中染成深蓝色的白髓细胞集团相对正常组破坏严重,说明淋巴组织受到损坏;正源方各剂量给药组小鼠造血细胞增生活跃,各系统造血细胞比例及形态较模型组多且增殖活跃,特别是正源方低剂量组,除了造血细胞的形态和数量已经接近正常组,其白髓细胞也基本恢复到正常组水平,说明正源方低剂量组小鼠的造血功能和免疫性能受辐射损坏较少。见图1。
图 160Co-γ射线照射小鼠的脾脏切片观察Fig.1 Sections of sp leen tissue of60Co-γray irradiated m ice
3.6.2 正源方对60Co-γ射线照射后小鼠睾丸的影响 小鼠睾丸组织切片HE染色结果显示,正常组小鼠睾丸,生精上皮 (管壁) 厚,细胞层次宽,各级生精细胞排列规则,基底面至腔面可见精原细胞、初级精母细胞、精子细胞等各个发育阶段的细胞,细胞增殖旺盛,可见到较多分裂期细胞,腔内可见成熟精子,间质稀少,血管丰富,间质细胞发育良好;模型组生精小管大部分退化变性,萎缩,生精上皮 (管壁)明显变薄,细胞层次减少,各级生精细胞排列紊乱甚至缺失,数量明显减少,生精小管腔内空虚,少见甚至未见成熟的精子,间质成分增宽,并且出现较大空隙,血管稀少,间质细胞减少或消失;正源方低剂量组小鼠睾丸的镜下表现与正常组基本相同,各级生精细胞排列较规则,细胞增殖旺盛,间质细胞发育良好,说明正源方低剂量组小鼠能抵抗辐射对生殖系统的破坏。见图2。
图 260Co-γ射线照射小鼠的睾丸切片观察Fig.2 Sections of testis tissue of60Co-γ ray irradiated m ice
4 讨论
随着核能及其放射技术在各个领域的广泛应用,辐射造成的损伤已成为人们日益关注的重要问题,特别是生殖、造血等系统对辐射污染较为敏感[6-7]。 临床进行放疗后容易引 起骨髓 抑制, 进而引起造血功能的破坏。辐射早期可表现为白细胞减少,严重时血小板、红细胞、血红蛋白均可降低,辐射晚期会发生造血功能障碍,免疫功能低下,恶性肿瘤发生,顽固性皮肤溃疡,以及多种器官纤维化[8-10]。此外, 睾丸组织对核辐射高度敏感, 核辐射可引起睾丸组织的损伤[11]。 因此, 核辐射会对人类造血 和 生 殖 系 统 功 能 产 生 破 坏 作 用[12-13]。 高效核辐射防护药物的研究,不仅有利于平时的电离辐射防护,保障职业工作者及患者的健康,而且对战时及突发核事故伤员的及时救治、减少伤亡等也具有十分重要的意义[14]。
正源方来源于中医临床门诊,组方以中医药理论为基础,方中西洋参大补气阴,当归补血活血,南沙参养阴润燥,仙鹤草止血生血,重楼解毒止痛,各司其工,各奏其效,其作用确切,为广大患者所接受。
本研究通过60Co-γ射线辐射损伤小鼠模型来研究正源方的疗效。由于造血干细胞具有很高的辐射敏感性,受照射后其数量急剧减少,导致外周血中成熟血细胞来源匮乏,小鼠受照射后造血系统受到损伤,故外周血白细胞、血小板的数量以及脾脏指数均呈不 同 程 度 的 降 低[15-16]。 模型 组 小 鼠在 接 受5.5 Gy60Co-γ射线全身照射后, 其白细胞、血小板、脾脏指数、睾丸指数以及精囊前列腺指数明显降低, 与正常组比较有显著性差异 (P<0.05 或P<0.01),提示60Co-γ射线能够对小鼠造血系统和生殖系统造成损伤。在小鼠造模前后连续灌胃给予皂矾丸及各剂量正源方,实验结果表明,相对于正源方高、 中剂量组, 3.00 g/kg低剂量的正源方提取液对60Co-γ射线照射小鼠造成的造血和生殖系统损伤有显著保护作用,能明显提升辐射小鼠的白细胞、血小板数量,提高脾脏指数、睾丸指数和精囊前列腺指数 (P<0.05 或 P<0.01), 脾脏和睾丸切片结果显示正源方低剂量组小鼠造血组织和生殖细胞受辐射损伤最小,表明低剂量正源方能增强辐射小鼠免疫力和生殖机能,促进其体质量增长,对辐射损伤有一定的保护和修复作用。本研究的结果证明正源方对辐射小鼠的造血系统和生殖系统损伤有显著的保护作用,为军事、医疗等方面开发一种新的中药抗辐射防护剂奠定了基础。
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Protective effect of Zhengyuan Prescription on m ice injured by60Co-γray irradiation
QU Yong-hong1,2, WANG Peng-yuan2, WANG Xiao-juan2*, TANG Zhi-shu1*, TANG Jun-qi3
(1.Collegeof Pharmacy, ShaanxiUniversity of ChineseMedicine, Xianyang 712046, China; 2.Departmentof Pharmacy, School of Stomatology, Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China; 3.Xi’ an Medical College, Xi’an 710021, China)
AIM To study the protective effect on hematopoietic and reproductive injuries ofmice caused by60Co-γray irradiation of Zhengyuan Prescription ( Panacis quinquefolii Radix, Angelicae sinensis Radix, Adenophorae Radix, Agrimoniae Herba, Paridis Rhizoma).METHODS Mice were random ly divided into control group,model group, Zaofan Pills group, and three Zhengyuan Prescription groups with high, medium and low dose, respectively.Except the control group, the othermice were exposed to whole-body irradiation of 5.5 Gy60Co-γray. White blood cells( WBC),platelets(PLT) and body weightwere recorded after irradiation.The organ indexes of heart, liver, spleen, lung, kidney, testis and seminal vesicle prostate weremeasured and the pathological changes in spleen and testis were observed under themicroscope.RESULTS Compared with the model group, the number of peripheral WBC, PLT and spleen indexes of drug-treated group significantly increased ( P<0.05 or P<0.01) , especially in the group with low dose of Zhengyuan Prescription.Importantly, low does of Zhengyuan Prescripition statitically improved the number of platelet than Zaofan Pills inmice( P<0.01) .The indexesof the tes-tis and seminal vesicle prostatewere highly improved in drug-treated group ( P<0.01 or P<0.05) , and the indexes of the group with low dose of Zhengyuan Prescription improved themost, while Zaofan Pills group did not show similar results(P>0.05 ) .Sections of spleen and testis tissue results showed that the group with low dose of Zhengyuan Prescription had a better curative effect on irradiation injury of mice.CONCLUSION Zhengyuan Prescription prevents the damages of hematopoietic organ and reproductive system in mice and promotes the recovery of peripheralWBC and PLT, the regeneration of hematopoietic cells in spleen , and the proliferation of germ cells in testis on mice irradiated by the60Co-γray.
Zhengyuan Prescription; irradiation injury; hematopoietic system; reproductive system
R285.5
: A
: 1001-1528(2014)03-0468-06
10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.006
2013-03-14
国家十二五 “ 重大新药创制” 科技重大专项 (2011ZX09401-308-037 ) ; 陕西省教育厅产 业化项目 (08JC16) ; 陕西省重点科技创新团队计划项目 (2012KCT-20)
曲永红 ( 1986—), 男, 硕 士 生, 研 究 方 向: 中 药 新 剂 型 新 工 艺 的 应 用。 Tel: ( 029 ) 84773998, E-mail: quyonghong0359 @126.com
*通信作者: 王晓娟 (1962—) , 女, 主任药师, 研究方向: 药剂学。 E-mail: wxjyh231@fmmu.edu.cn唐志书 (1972—) , 男, 教授, 研究方向: 中药物质基础与制备技术。 E-mail: tzs6565@163.com