金欣口服液对 RSV感染 BALB/c小鼠肺组织 TLR4 及 TAK1 表达的调控作用

李 涛， 汪受传， 戴启刚

（南京中医药大学中医儿科研究所， 江苏 南京 210029）

金欣口服液对 RSV感染 BALB/c小鼠肺组织 TLR4 及 TAK1 表达的调控作用

李 涛， 汪受传*， 戴启刚

（南京中医药大学中医儿科研究所， 江苏 南京 210029）

目的 通过观察金欣口服液 (炙麻黄、 苦杏仁、 生石膏、 黄芩等) 对呼吸道合胞病毒 (RSV) 感染肺组织TOLL样受体 4(TLR4) 及转化生长因子 β活化激酶 (TAK1) 表达的调控趋势， 探讨金欣口服液抗病毒机制以及TLR4 信号通路途径。 方法 RSV滴鼻感染 BALB/c小鼠， 金欣口服液给药进行干预， 并于首次滴鼻后 24 h 取各组小鼠肺组织， Western Blot法检测小鼠肺组织 TLR4、 TAK1 蛋白表达。 结 果 RSV感 染 BALB/c小鼠后 24h， TLR4 ﹑TAK1 蛋白表达明显升高 (P＜0.01)， 而金欣口服液组较 RSV感染组 TLR4 ﹑ TAK1 表达明显下调 (P＜0.01)； 金欣组蛋白表达量最低， 与利巴韦林组相比， P＜0.01， 利巴韦林组与 RSV感染组相比 P＜0.01。 结论 金欣口服液能抑制 TLR4 信号转导通路中 TLR4/TAK1 蛋白的表达， TLR4 的蛋白表达与 TAK1 的蛋白表达呈正相关， 金欣口服液抗RSV作用机制中的 TLR4 信号通路途径可能是通过 TAK1 实现的。

金欣口服液； 呼吸道合胞病毒； 肺组织； 小 鼠； TLR4； TAK1

金欣口服液 (原名清肺口服液) 是全国名老中医汪受传教授治疗小儿病毒性肺炎的有效验方。本课题组经过前期的临床及实验研究已经证实了金欣口服液对呼吸道合胞病毒 (RSV) 有抑制作用［1］，金欣口服液含药血清能下调 RSV活化诱导的 TLR3 及其下游炎症因子 IL-6 的高表达， 推测其为金欣口服液抗 RSV感染的机制之一［2］。 赵霞等人研究证实金欣口服液在 RSV感染早期， 可能通过调控凋亡相关基因拮抗其抑制细胞凋亡的作用，从而影响进入细胞内的病毒复制增殖过程，阻止病毒的扩散［3］， 而且金欣口服液抗 RSV的机制可能与其通过上调 RSV感染宿主体内 I型干扰素的表达， 从而发挥 I型干扰素的抗病毒效应有关［4］。徐建亚等人通过实验研究认为金欣口服液含药血清可以通过下调 TLR4 和 TNF-α表达水平减轻感染 RSV后 Hep-2 细胞的病变程度［5］。 本实验拟通过检测金欣口服液对呼吸道合胞病毒 (RSV) 感染 BALB/c小鼠24 h 后肺组织不同给药的 TLR4、 TAK1 蛋白表达，从而进一步研究金欣口服液发挥抗病毒的作用机制以及 TLR4 信号通路途径。

1 材料

1.1 动物与病毒 清洁级 BALB/c小鼠， 雌性18 ～22g(扬州医学院比较医学中心， 生产许可证:2021430) 南 京 中 医 药 大 学， 使 用 许 可 证，SYXK(苏)2005—0009； 呼吸道合胞病毒 A亚型Long株 (武汉国家典型培养物保藏中心)。

1.2 药品与试剂 金欣口服液 (原名清肺口服液)， 方由炙麻黄 3 g、 苦杏仁 10 g、 生石膏 20 g、黄芩 6 g、 葶苈子 10 g、桑白皮 10 g、 前胡 10 g、虎杖12 g组成，上药加水煎煮两次， 其中生石膏加 10 倍量水先煎 30 min， 与此同时将剩余药物在另一个容器中加 10 倍量水浸泡 30 min 后两锅合并， 大火煮沸， 小火继续煎煮 1.5 h，药液用 4 层纱布过滤，剩余药渣加8倍量水，大火煮沸后小火继续煎煮1 h， 4层纱布滤出药液， 合并两次药液后静置过夜，漏斗塾两层棉花抽滤去除部分沉淀，滤出液用旋转蒸发仪低压浓缩至1 L，得到质量浓度为 1.351 g/L的金欣口服液。此次课题实验所用金欣口服液由南京中医药大学植物药与新药开发研究中心 (江苏省植物药深加工工程中心) 制备；利巴 韦 林 注 射 液 (1 mL:0.1 g， 国 药 准 字H19999427， 南 京 金陵 药 业 股 份 有 限 公 司；100 mg:1 m L， 南京金陵药业股份有限公司)； 兔抗TLR4、 TAK1 多克降抗体 (Abcam， USA)； β-Actin、 羊抗兔 HRP标志二抗 (美国 CST公司)； 蛋白裂解液 RIPA(增强型)、 PMSF(碧云天生物技术有限公司)； 29 ∶1 丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺混合物 (Acr-Bis)、 10%十二烷基磺酸钠、 过硫酸铵(美国伯乐)；5 倍上样缓冲液、预染蛋白分子量标准 Marker(10 ～170 KD， 南京生兴生物技术有限公司)； PVDF膜 (0.45 μm孔径)， Millipore； 封口膜， Parafilm； 胶片 (柯达公司)；伊利牌脱脂奶粉 (伊利乳业有限公司)； 余为国产分析纯。

1.3 实验仪器材 高速台式冷冻离心机 Centrifuge 5810R； 电泳槽、Trans-Blot-SD半干转印槽 ( 美国 Bio-rad)； EXL800 型 酶 标 仪 ( 美 国 BioTek 公司)； 超 低 温 冰 箱 ( 美 国 Theromo公 司)； RE-2000B型旋转蒸发器 (上海亚荣生化仪器厂)； 面包式离心机、 移液枪 (德国 Eppendorf公司)； 电子天平 (上海天平仪器厂)； 漩涡振荡器、 水平摇床 (江苏海门麒麟医用仪器厂)； 制冰机 (美国Scotsman 公司)； 紫外凝胶成像仪 Alphalmager HP (Alpha innotech， USA)。

2 方法与结果

2.1 RSV感染 BALB/c小鼠肺炎模型的制备及分组 健康 BALB/c小鼠， 常规饲养于无病原体环境中 3 d 后开始正式试验。 RSV感染模型制备: 除正常组外，其余各组 BALE/c小鼠在乙醚浅麻后鼻腔滴注 100TCID50的 RSV悬液每只 50 μL( 每天滴鼻1次， 正常组给予相同剂量的无血清DMEM高糖培养基)，待全部吸入鼻腔后放回笼中并记录时间。将 BALB/c小鼠分为正常组、 RSV感染组、 利巴韦林组、 金欣中药组 4 个小组 (n=5)。 药物剂量:参照文献［6］提供实验动物和人临床用药剂量换算采用公式 d B=dA×RB/RA×

dB是欲求算的 B种动物 (包括人) 的千克体质量剂量、 dA是已知 A种动物， 包括人的千克体质量剂量； WA、 WB是已知动物 A、 B的体质量；RB、 RA是 A、B动物的体型系数。

金欣口服液儿童临床用量为 6 g/kg， 根据公式得出实验 BALB/c小鼠的给药剂量，金欣等效剂量为 27.6 g/(kg·d)(相当于 2 岁儿童临床等效剂量)， 利巴韦林儿童临床用量为 10 mg/(kg·d)，根据公式得出 BALB/c小鼠利巴韦林给药剂量为46 mg/(kg·d)(相当于 2 岁儿童临床等效剂量)； 每次 0.2 m L/10 g根据给药量制备相应浓度的药物，正常组和 RSV感染模型组给予相同量的生理盐水。给药方式: 提前连续给药3 d， 每天灌胃2次， 两次间隔 8 h， 末次给药后 2 h 进行 RSV滴鼻， RSV首次滴鼻后24 h取样品，在麻醉下处死小鼠开胸取肺组织， 其中肺左叶供 Western Blot实验用， 分装保存于液氮中， 全部取完后放入 -70 ℃冰柜中保存。

2.2 Western Blot法 检 测 BALB/c小 鼠 肺 组 织TLR4、 TAK1 蛋白表达 将组织从 -70 ℃冰箱中取出，并准备一罐液氮，准备研磨工具，将研磨过的肺组织装入 1.5 ml Dolf管内，并称定质量， 加入增强型 RIPA与 PMSF混合液 (两者比例 100 ∶1) 加入混合液的量与组织的比为 5 ∶1，4 ℃下13 000 r/min离心 30 min， 取上清， 即为所提取之BALB/c小鼠肺组织总蛋白。 BCA法蛋白定量并根据结果调整使各样品总蛋白含量一致，5倍上样缓冲液蛋白变性， 5%浓缩胶及 10%分离胶 SDSPAGE凝胶电泳， PVDF膜转印， 5%TBST脱脂奶粉封闭2 h， 1 ∶500 兔源性 TLR4、 TAK1 一抗 4 ℃孵育过夜、1 ∶5 000羊抗兔二抗孵育 2 h， ECL法显色， 胶片压片。 采用 Photoshop 图像分析软件分析蛋白条带灰度值， 以 β-actin 作为内参照蛋白进行校准， 采用目标蛋白条带灰度值 /β-actin 条带灰度值来表示蛋白相对表达水平。

2.4 结果

2.4.1 金欣口服液对 RSV感染 BALE/c小鼠肺组织 TLR4、TAK1 表达的影响 运用 Western Blot法检测 TLR4 信号转导通路中 TLR4、 TAK1 蛋白表达水平， 结果如图 1、 表 1 所示。 可见 RSV感染BALE/c小鼠后， TLR4、TAK1 蛋白的表达明显升高 (P＜0.01)， 而金欣口服液则能降低 RSV感染后 TLR4、 TAK1 蛋白表达水平 (P＜0.01 或 P＜0.05)， 作用优于利巴韦林组 (P＜0.01)， 同时TLR4、 TAK1 蛋白相对表达水平经双变量相关分析， Pearson 相关系数 r=0.980 ﹑ P=0.000 提示两者的蛋白表达呈正向直线相关。

图 1 RSV感染 BALE/c小鼠后， TLR4、 TAK 1 蛋白表达显影图Fig.1 Developing Fig of TLR4、 TAK 1 protein exp ression after BALB/cm ice infected w ith respiratory syncytia viru

表 1 RSV感染 B ALE/c小鼠后， TLR4、 TAK 1 蛋白相对表达水平 （， n=5）Tab.1 Relative expression levels of TLR4、 TAK1 protein expression after BALB/cm ice infected with respiratory syncytia viru（， n=5）

表 1 RSV感染 B ALE/c小鼠后， TLR4、 TAK 1 蛋白相对表达水平 （， n=5）Tab.1 Relative expression levels of TLR4、 TAK1 protein expression after BALB/cm ice infected with respiratory syncytia viru（， n=5）

注: 与 RSV感染组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01； 与利巴韦林组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01

组 别TLR4/β-actinTAK1/β-actin正常组1.332 ±0.105▲▲0.526 ±0.006▲▲RSV感染组1.815 ±0.1210.847 ±0.033利巴韦林组1.125 ±0.078▲▲0.370 ±0.018▲▲金欣口服液组0.768 ±0.097▲▲**0.120 ±0.005▲▲**

3 讨论

呼吸 道 合 胞 病 毒 (respiratory syncytial viral，RSV) 是有包膜非片段性的单股负链 RNA病毒，是导致婴幼儿下呼吸道感染最为重要的病毒病源［7］， 而 RSV在活化诱导 TOLL样受体 (Toll-like receptors， TLRs) 信号转导通路中扮演着重要的角色［8］， 人 体 中 已 经 发 现 11 个 TLRS 成 员， 其 中TLR4 是 与 RSV 关 系 最 为 密 切 的 TLRs之 一［9］，TLR4 作为病毒包膜糖蛋白的识别对象， RSV的融合蛋白 (F) 是活化 TLR4 的病毒成分［10］。 在 RSV感染的上皮细胞的过程中， TLR4 通过引起 LPS 介导的 IL-6 反应而起到重要作用， 而且很可能是影响上皮细胞趋化因子与病毒和内毒素相互作用的一个重要因素，这和 RSV疾病的表型有关［10］。 除了通过 MyD88 依赖性信号途径诱导 NF-K B活化和炎症细胞因子的分泌外， TLR4 也可通过 TRIF/TRAM依赖性信号通路， 激活由脂多糖 (LPS) 介导所致的各种细胞炎症反应［11］。 TOLL样受体家族在调节机体天然免疫和获得性免疫反应中扮演着重要角色， TLR4 信号通路途径又是与 RSV关系最为密切的。 稳态下， 机体存在 TLRs的复性调节， 适时终止 TLRS 信号通路， 避免过强的免疫反应。 如可溶性 TLR4(sTLR4) 竞争相应的配体、 细胞因子信号传导抑制因子 (SOSC1) 通过抑制 IRAK活性，加速 MyD88 样转接蛋白 (Mal， 也称 TIRAP) 的降解、 胞浆锌脂蛋白 (A20) 将 TRAF6 去泛素化等途径调控 TLR4 的信号通路［12］。 TRAF6 活化转化生长因子 β活化激酶 (TAK1)， 后者激活 IκB激酶 (IKKs， 包括 IKKα、 IKKβ、 IKKγ)， 进而活化NF-κB。当 NF-κB进入核内，从而促进 TNF-α、 IL-6、 IL-8、 IL-12 等细胞因子的表达； 我们推测， 金欣口服液可能通过调控 RSV诱导活化的 TLRs信号通路来间接发挥抗病毒作用，起作用靶点可能存在于 TLRs或其信号通路中， 而 TAK1 是其信号通路中重要的衔接蛋白之一， 从而发挥抗 RSV感染所致的炎症反应。 本课题组通过 Western Blot实验方法， 研究金欣口服液对呼吸道合胞病毒 (RSV) 感染 BALB/c小鼠 24 h 后肺组织不同给药的 TLR4、TAK1 的蛋白表达水平， 从而进一步研究金欣口服液发挥抗病毒的作用机制以及 TLR4 信号通路途径。以及进一步探索该中药的作用靶点和分子机制。 结果发现:RSV感染 BALB/c小鼠后 24 h，TLR4、 TAK1 蛋白表达与正常组比较明显升高(P＜0.01)， 而金欣口服液组较 RSV感染组 TLR4、TAK1 蛋白表达明显下调 (P＜0.01)； 金欣中药组能同时降低 RSV感染后 24 h TLR4、 TAK1 蛋白表达水平 (与 RSV感染组相比， P＜0.01) 金欣中药组蛋白表达量最低，与利巴韦林组相比，P＜0.01， 利巴韦林组与 RSV感染组相比 P＜0.01。

综上所述金欣口服液能抑制 TLR4 信号转导通路中 TLR4/TAK1 蛋白的表达， 而 TLR4 的蛋白表达与 TAK1 的蛋白表达呈正相关， 也就是说金欣口服液发挥抗 RSV作用机制中的 TLR4 信号通路途径可能 是 通 过 TAK1 来 发 挥 作 用 的， 即 TLR4/ MyD88/TAK1/NF-κB/TNF-α途径， 我们将进一步研究 TLR4 信号通路的其它可能作用靶点， 采用更多的实验技术如激光共聚焦扫描显微镜技术、ELISA、 免疫荧光等实验技术以及采用不同给药时间如 48 ﹑ 72 ﹑ 144 h 等来提供更加有力的证据，从而进一步揭示出金欣口服液可能的抗 RSV感染途径。

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Effect of Jinxin Oral Liquid on expression of lung TLR4 and TAK 1 of BALB/c m ice infected with RSV

LITao， WANG Shou-chuan*， DAIqi-gang
(Institute of Pediatrics of ChineseMedicine， Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210029， China)

AIM To study the effect of Jinxin Oral Liquid(Ephedrae Herba， Armeniacae Semen amarum， Gypsum fibrosum，Scutellariae Radix，etc.)on the expression of Toll-like receptor4(TLR4)and TAK1 ofmice lung tissues infected with respiratory syncytial virus(RSV)and explore Jinxin Qral Liguid's anti-viral mechanism and TLR4signal path.METHODS BALB/c mice were intranasally inoculated with RSV， and then treated with Jinxin Oral Liquid.After 24 hours of inoculated with RSV， themice were killed and the lung sampleswere collected， and then the expression of TLR4 and TAK1 wasmeasured by Western Blot.RESULTS The results demonstrated that after being infected twenty-four hours， the expression of TLR4 and TAK1 were up-regulated significantly(P＜0.01)， but in oral liquid group were down-regulated compared with the RSV infected group(P＜0.01).The level of protein expression in Jinxin group was the lowest， compared with that in Ribavirin group(P＜0.01) ， and the Ribavirin group compared with the RSV infected group(P＜0.01).CONCLUSION Jinxin Oral Liquid can inhibit the expression of TLR4/TAK1 in signal transducing pathway of TLR4 in a positive correlation between TLR4 and TAK1， the antiviralmechanism of TLR4'signal transducing pathwaymay be related to TAK1.

Jinxin Oral Liquid； respiratory syncytial virus(RSV)； lung tissue； mice； TLR4、 TAK1

R285.5

:A

:1001-1528(2014)02-0225-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.02.002

2013-03-21

国家自然科学基金 (81072840)； 高校博士点专项科研基金 (201003237110003)

李 涛 (1987—)， 男， 硕士生， 从事小儿肺系疾病的研究。

*通信作者: 汪受传， 男， 教授， 研究方向: 小儿肺系疾病的研究。 Tel:(025)86798182， E-mail:wscnj@126.com