秦皮甲素对肺癌小鼠抑瘤作用的研究

王 晶

（辽宁医学院附属第一医院， 辽宁 锦州 121000）

秦皮甲素对肺癌小鼠抑瘤作用的研究

王 晶

（辽宁医学院附属第一医院， 辽宁 锦州 121000）

目的 探讨秦皮甲素对小鼠肺癌移植瘤的影响及作用机制。 方法 分组对比观察秦皮甲素对小鼠 Lewis肺癌移植瘤的影响， 瘤组织称重计算抑瘤率， 免疫印迹法检测秦皮甲素对凋亡基因 Bax、 Bcl-2 的影响。 流式细胞仪检测瘤细胞增殖周期及凋亡， JC-1 染色检测线粒体膜电位。 结果 秦皮甲素可抑制小鼠肺癌移植瘤的生长和瘤细胞的增殖周期， 降低线粒体膜电位， 在上调 Bax蛋白表达的同时下调 Bcl-2 蛋白表达， 且呈剂量依赖性。 结论 秦皮甲素对小鼠肺癌移植瘤有显著的抑制作用。使肿瘤细胞阻滞于S期，并通过线粒体途径诱导凋亡。

秦皮甲素；肺癌；线粒体途径

秦皮甲素是中药秦皮中的主要成分，在秦皮中含有量高 (1.436% ～3.043%)。 秦皮甲素是秦皮发挥药理作用最重要的成分，对机体各系统作用广泛，具有抗肿瘤、抗微生物、抗氧化与消除自由基等作用［1］。 在前期我们研究了秦皮甲素对肺癌细胞 H125 的影响， 发现秦皮甲素可抑制肺癌细胞的增殖并诱导凋亡［2］。 但是， 秦皮甲素在体内对肺癌移植瘤模型是否发挥作用，对肿瘤相关癌基因与抑癌基因的表达是否有影响等方面还需要进一步探讨。因此，我们需要利用现代药学研究手段，对秦皮甲素抗肺癌作用进行研究，掌握其作用机制，以更好地利用我国独特的中药资源优势，为临床服务。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 动物及瘤株 C57BL/6 j小鼠， 雄性， 6 ～8周龄， 20 ～22 g。 购于中国医科大学动物实验中心。

Lewis肺癌细胞株， 购于中国科学院上海分院细胞库。

1.2 药物 秦皮甲素， 购于中国药品生物制品检定 所， 批 号 200104。顺 铂， 批 号 20120902 (江苏豪森药业股份有限公司)。 兔抗人 Bax抗体 (SANTA CRUZ公司， 型号 SC—526)。 兔抗人 Bcl-2 抗 体 (SANTA CRUZ公 司， 型 号 为 SC-429)。

1.3 试 剂 线 粒 体 膜 电 位 检 测 试 剂 盒 (JC-1) (碧云天生物技术研究所)； 线粒体提取试剂盒(南京建成生物工程研究所)； 胰蛋白酶 (Hyclone公司)； 小牛血清 (杭州四季青生物制品公司)；DMEM培 养 基 干 粉 (GIBCO 公 司 ) ； Annexin VFITC凋亡试剂盒 (北京宝赛生物公司)； 碘化丙啶(Amresco公司)； 细胞周期检测试剂盒 (南京凯基生物科技发展有限公司)。

1.4 仪器 流式细胞仪 (BD FACSCaLibur)； 超净工作台 (江苏吴县市净化技术研究所)； 二氧化碳 培 养 箱 (Sheldon Manufacturing IncUSA)； KA-1000C型飞鸽离心机 (上海安亭科学仪器厂)；CX21 型双目生物 显 微 镜 ( 日本 Olympus公 司)；WD-9413B型凝胶成像分析仪 (上海圣科仪器设备有限公司)； DYY-7C型电泳仪 ( 北京六一仪器厂)。

2 试验方法

2.1 动物模型的建立 Lewis细胞常规复苏， 传代， 用含 10% 小牛血清 的 培 养 基， 在 5%CO2，37 ℃细胞培养箱内常规培养。 0.25%胰蛋白酶消化传代， 待细胞长至 80%融合时进行实验。 取对数生长期细胞， 调整细胞密度为 2 ×108个/mL。将制备好的单细胞悬液接种于小鼠右腋皮下，每只0.2 mL。模型复制成功后，随机分为 5 组，每组15 只， 即阴性对照组 (生理盐水 0.2 mL)； 阳性对照组 (顺铂 100 mg/kg)； 秦皮甲素高、 中、 低剂量组 (400、 200、100 mg/kg)。用药后第 20 天处死全部小鼠， 进行指标观察［3-5］。

2.2 抑瘤率 取各组瘤组织称定质量， 计算抑瘤率。 抑瘤率 (%)=(1-治疗组平均瘤重/生理盐水组平均瘤重) ×100%

2.3 细胞周期检测 取少许瘤组织， 用生理盐水研磨， 4 ℃预冷， 70%乙醇固定， 检测前离心弃去固定液， PBS液重悬， 然后按照细胞周期检测试剂盒的要求进行操作。用流式细胞仪分析细胞周期［4］。

2.4 细胞凋亡检测 取少量瘤组织， 用生理盐水研 磨， 采 用 Annexin V-FITC 染 色， 加 入10μLAnnexinV-FITC和 5 μLPI， 轻轻混匀， 室温避光反应 10 ～15 min 后用流式细胞仪进行检测。 所得数 据 经 Bioconsort专 用 软 件处理， 分析 细 胞 凋亡率［5］。

2.5 JC-1 染色检测线粒体膜电位 称取 200 mg瘤组织， PBS 冲洗， 制备细胞匀浆。4 ℃ 800 ×g离心 5 min。 在另 一 个 新 的 预 冷 的 离 心 管中 加 入0.5 mL Medium Buffer， 将匀浆后的上清液沿管壁小心加入该离心管中， 4 ℃ 15 000 ×g离心 10min，上清转移至新离心管。重悬线粒体沉淀，4℃15 000 ×g离心 10 min， 弃 上 清。 用 50 mL Store Buffer重悬线粒体沉淀。 然后按线粒体膜电位检测试剂盒的说明书操作。用流式细胞仪进行检测，结果用绿色荧光细胞百分率表示。

2.6 免疫印迹法检测 Bax、 Bcl-2 蛋白的表达 将存于 -80 ℃冰箱中的组织解冻加入裂解液， 于4 ℃下裂解 30 min， 4 ℃高速离心后取上清液并测定蛋白含有量， 加入上样缓冲液混匀， -20 ℃冰箱中保存。应用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)， 半干法转膜。 加入一抗， 4 ℃过夜， 洗膜。加入二抗，室温下在摇床上杂交 1 h，洗膜3次。显色，结果应用生物凝胶图像分析系统进行扫描照相［6］。

2.7 统计学处理 采用 SPSS 17.0 统计软件进行数据分析，数据均以表示。 进行 t检验。 P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 秦皮甲素对小鼠移植瘤的抑制作用 秦皮甲素治疗后，秦皮甲素组和顺铂组瘤重较阴性对照组明显减轻 (P＜0.05)， 结果见表1。 因秦皮甲素中剂量组和顺铂组的抑瘤率无明显差异。因此在以后的检测试验中，我们仅选用秦皮甲素中剂量组与顺铂组进行比较。

3.2 秦皮甲素对肺癌移植瘤小鼠肿瘤细胞周期的影响 各组小鼠肿瘤细胞周期各时相的分布数据见表2。结果表明，顺铂组和秦皮甲素组均可以使瘤细胞G2/M期的比例减少， S 期的比例增加。与阴性对照组比较， 差异显著 (P＜0.05)。

3.3 秦皮甲素对肺癌移植瘤小鼠肿瘤细胞凋亡的影响 由表3可见，秦皮甲素组与顺铂组均可诱导瘤细胞凋亡，与生理盐水组比较差异显著 (P＜0.05)。

表 1 秦皮甲素对小鼠移植瘤的抑制作用 （ n=15，）Tab.1 Inhibition effects of aesculin on Lew is lung cancer xenografts in m ice（ n =15，）

表 1 秦皮甲素对小鼠移植瘤的抑制作用 （ n=15，）Tab.1 Inhibition effects of aesculin on Lew is lung cancer xenografts in m ice（ n =15，）

注: 与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01

组 别剂量 /(mg·kg-1·d-1)动物数 /只瘤重指数抑瘤率 /%生理盐水组-151.310 2 ±0.102 4-顺铂组100150.581 7 ±0.001 355.6%**秦皮甲素低剂量组100150.741 5 ±0.015 843.41%**秦皮甲素中剂量组200150.601 3 ±0.017 254.1%**秦皮甲素高剂量组400150.478 2 ±0.005 163.5%**

表2 秦皮甲素对肺癌移植瘤小鼠肿瘤细胞周期的影响（n=15，）Tab.2 Effects of aesculin on cell cycle of Lew is lung cancer xenografts inm ice（n=15，）

表2 秦皮甲素对肺癌移植瘤小鼠肿瘤细胞周期的影响（n=15，）Tab.2 Effects of aesculin on cell cycle of Lew is lung cancer xenografts inm ice（n=15，）

注: 与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组 别G0/G1SG2/M生理盐水组35.930 ±0.035.850 ±0.0235.210 ±0.04顺铂组32.390 ±0.079.970 ±0.05*27.150 ±0.09*秦皮甲素组30.238 ±0.239.820 ±0.05*26.090 ±0.15*

表3 秦皮甲素对肺癌移植瘤小鼠肿瘤细胞凋亡的影响（n=15，）Tab.3 Effects of aesculin on cell apoptosis of Lewis lung cancer xenografts in m ice（ n =15，）

表3 秦皮甲素对肺癌移植瘤小鼠肿瘤细胞凋亡的影响（n=15，）Tab.3 Effects of aesculin on cell apoptosis of Lewis lung cancer xenografts in m ice（ n =15，）

注: 与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组 别凋亡率/%生理盐水组0.08 ±0.017顺铂组12.310 ±0.095**秦皮甲素组13.529 ±0.054**

3.4 秦皮甲素对肺癌移植瘤小鼠线粒体膜电位的影响 JC-1 荧光探针检测线粒体膜电位， 结果显示，顺铂组与秦皮甲素组均可降低线粒体膜电位。结果见表 4， 图 1。

表4 秦皮甲素对肺癌移植瘤小鼠线粒体膜电位的影响（n=15，）Tab.4 Effects of aesculin on m itochondrialmembrane potential of Lewis lung cancer xenografts in m ice（n=15，）

表4 秦皮甲素对肺癌移植瘤小鼠线粒体膜电位的影响（n=15，）Tab.4 Effects of aesculin on m itochondrialmembrane potential of Lewis lung cancer xenografts in m ice（n=15，）

注: 与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组 别绿色荧光细胞百分率/%生理盐水组1.35 ±0.24顺铂组21.04 ±0.47**秦皮甲素组19.27 ±0.39**

3.5 秦皮甲素对肺癌移植瘤小鼠 Bax、 Bcl-2 蛋白表达的影响 由图2可知，顺铂组和秦皮甲素组与生理盐水组比较，Bax蛋白表达增强而 Bcl-2 蛋白表达受到抑制。

图 1 秦皮甲素对肺癌移植瘤小鼠线粒体膜电位的影响 （n=15）Fig.1 Effects of aesculin onm itochondrialmembrane potential of Lewis lung cancer xenografts in m ice（ n=15）

4 讨论

肺癌是最常见的恶性肿瘤，多数学者认为，治疗肿瘤最有效的途径是直接诱导肿瘤细胞凋亡，因此，诱导肿瘤细胞凋亡已成为治疗肿瘤的新靶点、新思路［7］。 中药诱导肺癌细胞凋亡是一个新兴的课题，随着其研究的不断深入，对于揭示中药的作用机制，筛选抗肿瘤新药，均具有十分重要的意义［8］。

秦皮是常用中药，秦皮甲素是中药秦皮中的主要有效成分。通过体内试验我们发现，秦皮甲素可以抑制小鼠肺癌移植瘤的生长，且呈剂量依赖性。

图 2 秦皮甲素对肺癌移植瘤小鼠 Bax、 Bcl-2 蛋白表达的影响Fig.2 Effects of aescu lin on Bax and Bcl-2 p rotein of Lewis lung cancer xenografts in m ice

肿瘤的发生、发展与凋亡异常密不可分，所以研究能够促进凋亡的抗癌药物是目前肿瘤治疗的主要手段之一。已知两种信号途径可以诱导凋亡发生，即死亡受体途径和线粒体途径。在线粒体途径中，线粒体膜电位降低是细胞凋亡的早期特征，通过体内试验，我们看到秦皮甲素可以使瘤组织的线粒体膜电位下降而诱导凋亡。线粒体在细胞凋亡中的重要性还在于它与 Bcl-2 基因家族的关系。 Bcl-2家族在线粒体途径中起着重要的调控作用，它分为促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白。通过检测凋亡基因，我们发现秦皮甲素可以促进促凋亡蛋白 Bax的表达，抑制抗凋亡蛋白 Bcl-2 的表达， 这进一步证实线粒体途径是秦皮甲素诱导凋亡的重要机制［9-11］。

在细胞周期中， 最重要的调控点是 G1/S 调控点，细胞在该点分析细胞内外的各种复杂信号以及DNA损伤情况， 以决定细胞是进入分裂程序 S期，还是处于静止的 G0期。 通过流式细胞仪检测， 表明秦皮甲素可将肺癌移植瘤小鼠肿瘤细胞周期阻滞于 S 期， 使其不能进入 G2/M期， 即不能正常进行细胞周期活动［12-15］。

综上所述，秦皮甲素可抑制小鼠肺癌移植瘤的生长，并通过线粒体途径诱导瘤细胞凋亡。但秦皮甲素在体内外对肺癌侵袭、转移、黏附等方面是否有影响尚有待进一步深入研究。此外，秦皮甲素通过影响哪些通路、受体而发挥抗肺癌作用等均需要在以后的实验中深入探讨。

［ 1 ］ 方莲花， 吕 扬， 杜冠华.秦皮的药理作用研究进展［J］.中国中药杂志， 2008， 33(23):2733-2735.

［ 2 ］ 王 晶.秦皮甲素对人肺癌细胞 H125 体外增殖的影响［J］.时珍国医国药， 2011， 22(2):507-509.

［3］ 彭 鹏，宋玉华，邱少敏，等.三氧化二砷对小鼠肺癌移植瘤治疗作用的研究［ J］.中华临床中医杂志， 2012， 6 (10):198-199.

［ 4 ］ 张 波， 柴 智.虫类攻毒法、 草木解毒法对小鼠 Lewis肺癌移植瘤的抑制作用及其机制的研究［J］.世界中西医结合杂志， 2011， 6(3):203-205.

［5］ 王 晶，王洪新，李红玉，等.秦皮乙素的制备及对人肝癌细胞 SMMC-7721 体外增殖的影响［ J］ .中国现代应用药学， 2009， 26(16):439-442.

［ 6 ］ 王丽红， 伟忠民.秦皮乙素对小鼠皮下 Hepal-6 肝癌移植瘤凋亡基因 Bcl-2、 Bax表达的影响［ J］ .中国药房， 2012，23(15):1356-1358.

［7］ 刘 岩，张 虹，金 雪，等.荷包牡丹碱诱导人肺腺癌细胞 A549 凋亡及其机制初探［J］.中国药学杂志， 2011，46(24):1890-1893.

［ 8 ］ 万 茜， 章永红.中药诱导肺癌细胞凋亡的研究进展［J］.河北中医， 2009， 31(4):628-630.

［ 9 ］ 梁靓靓， 陈苏宁， 蔡玉文.调气消积汤对 Lewis肺癌移植瘤血管生成影响的实验研究［ J］.中国中医药科技， 2011，18(4):284-286.

［10］ 迟淑萍， 高 蓉， 汪 辰， 等.海螵蛸衍生物 SC002 抗肿瘤相关分子机制的研究［J］.细胞与分子免疫学杂志，2011， 27(2):212-214.

［11］ 林 箐， 彭华毅.黄葵素诱导小鼠黑色素瘤 B16 细胞凋亡的研 究 ［ J］. 中 国 药 理 学 通 报， 2010， 26(12): 1630-1634.

［12］ 宋少华， 郭闻渊， 傅志仁， 等.丹参多酚酸盐通过线粒体途径诱导人肝癌 SMMC-7721 细胞的凋亡［ J］.中国肿瘤生物治疗杂志， 2010， 17(1):62-66.

［13］ 曲 佳， 郭坤元， 吴秉毅， 等.冬凌草甲素诱导人多发性骨髓瘤 ARH-77 凋亡及其可能机制［ J］.中国肿瘤生物治疗杂志， 2010， 17(2):134-138.

［14］ 贾永清， 滕 熔， 胡慧仙.亚硒酸钠对 HL-60 细胞增殖、凋亡影响及作用机制探讨［J］.交通医学， 2011， 25(2): 121-125.

［15］ 顾 后.中药对肺癌细胞增殖与凋亡影响的研究进展［ J］.云南中医中药杂志， 2007， 28(5):42-44.

Inhibitory effect of aesculin on m ice w ith Lew is lung cancer

WANG Jing

(First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University， Jinzhou， 121000， China)

AIM To explore the effect and mechanism of aesculin onmouse xenotransplanted Lewis lung cancer.METHODS Mouse Lewis lung cancer xenograft model was used to study the effect of aesculin on tumor growth.The tumor tissue was weighted to calculate the antitumor rate.Influence of aesculin on apoptotic genes Bax， Bcl-2 was determined byWestern blot.Distribution of tumor cell cycle and apoptotic cell death were analyzed by flow cytometry and mitochondrialmembrane potential JC-1 staining.RESULTS Aesculin inhibitedmouse lung tumor growth and tumor cell proliferation cycle and reduced the mitochondrialmembrane potential.Aesculin promoted Bax protein expression and at the same time lowered Bcl-2 protein expression in a dose dependentmanner. CONCLUSION Aesculin has a significant inhibition against the growth of mouse xenotransplanted Leise lung cancer， whose cycles are arrested at S phase.Aesculin could induce apoptosis through themitochondrial pathway.

Aesculin； Lewis lung cancer； mitochondrial pathway

R285.5

:A

:1001-1528(2014)02-0249-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.02.007

2013-03-11

辽宁省自然科学基金项目 (2013022063)

王 晶 (1974—) ， 女， 主管药师， 研究方向: 中药抗肿瘤药理。 Tel:15004162307， Email:wangjing2006050@126.com