白头翁皂苷D抗肝癌作用的药效学研究

徐 坤， 舒 展， 王永林， 许琼明， 杨世林， 刘艳丽*

（1.苏州大学医学部药学院， 江苏 苏州 215123； 2.贵阳医学院药学院， 贵州 贵阳 550004）

白头翁皂苷D抗肝癌作用的药效学研究

徐 坤1，2， 舒 展1， 王永林2， 许琼明1， 杨世林1，2， 刘艳丽1*

（1.苏州大学医学部药学院， 江苏 苏州 215123； 2.贵阳医学院药学院， 贵州 贵阳 550004）

目的 研究白头翁皂苷 D( 毛茛科植物白头翁 Pulsatilla chinensis(Bge.)Regel的干燥根) 体内抗小鼠 H22肝癌细和体外的抗人肝癌 SMMC-7721 作用。 方法 在体外实验中， 采用 MTT法考察白头翁皂苷 D对 SMMC-7721 细胞增殖的抑制作用； 在体内实验中， 采用小鼠 H22实体瘤进行体内抑瘤实验， 测定肿瘤生长抑制率， 利用光镜 (HE染色)、电镜等方法进行形态学观察。 结果 白头翁皂苷 D处理人肝癌 SMMC-7721 细胞 24、 48、 72h 后， 给药组均出现了不同程度的细胞增殖抑制。 白头翁皂苷 D(4.5、 6.0mg/kg) 对小鼠 H22肝癌细胞实体瘤的生长有明显的抑制作用， 抑瘤率分别为 38.67%和 41.59%(P＜0.01， 与模型组比较)。 组织学观察显示， 肿瘤细胞大量变性坏死， 电镜下可见凋亡细胞和凋亡小体。结论 白头翁皂苷D具有一定的体内、外抗肿瘤作用。

白头翁皂苷D；肝癌；抗肿瘤；细胞增殖；细胞凋亡

白头翁为毛茛科植物白头翁 Pulsatilla chinensis(Bge.)Regel的干燥根， 具有清热解毒、 凉血止痢、燥湿杀虫等功效，临床上用于治疗细菌性痢疾、 妇科阴道炎、 阿米巴痢疾等病症［1］。 近年来从正品白头翁中提取的新化学成分主要为皂苷类［2］。本课题组对白头翁化学成分进行研究时分离得到白头翁皂苷 D(pulsatilla saponin D)。

目前对白头翁抗肿瘤的研究主要集中在其粗提物的体内外实验［3-5］，Yong Kim等［6］研究发现，白头翁皂苷 D对人肺癌 A549 细胞等肿瘤细胞有明显的细胞毒活性， 且对 Lewis肺癌小鼠有显著的体内抑瘤活性。 因此本实验采用体外 MTT实验， 初步确定白头翁皂苷 D的抗肝癌作用， 其次， 建立 H22荷瘤模型，进一步观察白头翁皂苷D的抗肝癌作用，以期为确定白头翁抗肝癌作用的物质基础提供参考。

1 材料

1.1 药品与试剂 白头翁皂苷 D(Pulsatilla saponin D)， 苏州大学天然药物教研室提供； 注射用环磷酰胺 (0.2 g/支)， 批号 10072721， 江苏恒瑞医药股份有限公司。 MTT，美国 Amersco公司； RPMI 1640 培养基， 小牛血清， Gibco公司；其他试剂均为国药集团化学试剂有限公司产品。

白头翁皂苷 D结构鉴定: 白色粉末 (甲醇)，ESI-MS m/z935.2 ［M+Na］+(C47H76O17Na， 计算值 935.2)； Liebermann-Burchard 反应呈阳性； Molish 反 应 呈 阳 性。1H-NMR(500 MHz， C5D5N) δ: 1.01， 1.01， 1.08， 1.10， 1.17， 1.31(each 3H， s，CH3)，5.54(1H， brs， H-12)， 1.73(3H，brs， 6-H3of rha)， 6.33(1H，brs， 1-H of rha)， 5.06(1H，d， J=8.0 Hz， 1-H of glc) ， 5.19(1H， d， J=6.0 Hz， 1-H of ara)。13C-NMR(125 MHz， C5D5N) δ: 81.18(C-3)，122.72(C-12)， 145.03(C-13)，64.04(C-23)， 180.64(C-28)， 104.54(Cara-1)，76.42(Cara-2)， 75.15(Cara-3)， 80.56(Cara-4)，65.53(Cara-5) 。 101.82(Crha-1)， 72.41(Crha-2)， 72.59(Crha-3)， 74.27(Crha-4)， 69.78 (Crha-5)，18.76(Crha-6)， 106.89(Cglc-1)，75.62(Cglc-2)， 78.93(Cglc-3)， 71.37(Cglc-4)，78.69(Cglc-5)， 62.64(Cglc-6)。 以上数据与文献［7］ 报道一致，故鉴定化合物为白头翁皂苷 D (pulsatilla saponin D)。结构见图 1。

1.2 仪器 倒置荧光显微镜， eclipse TE2000-U型(日本 Nikon 公司)； Thermo MVLTISKANFC型酶标仪 (德国 Thermo Scientific公司)；BB-IS 型二氧化碳培养箱 ( 德国 Thermo Scientific公司)；超净台(苏州净化设备有限公司)； 22PC电子分析天平(上海精密科学仪器有限公司)； H-600 型透射式电子显微镜 (日本日立公司)。

图1 白头翁皂苷D结构式Fig.1 Structure of pulsatilla saponin D

1.3 细胞 人肝癌细胞 SMMC-7721、 H22腹水型小鼠肝癌细胞均购于中国科学院上海生命科学研究院。

1.4 动物 ICR小鼠， 清洁级， 雄性，体质量18 ～22 g， 动物合格证号 SCXK(沪)2007—0005。购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。

2 方法

2.1 细胞培养 复苏冻存的细胞， 离心去除冻存液， 加入 RPMI-1640 培养液 ( 含体积分数 10%已灭活的小牛血清、 青霉素 l×105U/L、 链霉素 100 mg/L)， 于 37 ℃、 5%CO2、 饱和湿度孵箱中静置培养。次日换液，3～4 d传代，取指数生长期细胞用于实验。

2.2 细胞增殖抑制实验 采用 MTT法［8］， 收集对数生长期 SMMC-7721 人肝癌细胞， 调整细胞悬液浓度至 1 ×105个/mL， 于 96 孔板每孔加入 100 μL， 置于 5%CO2、 37 ℃培养箱中培养 24 h 至细胞完全贴壁，加入不同质量浓度的白头翁皂苷D使终 浓 度 分 别 为 3.125、 6.25、12.5、 25、 50 μg/mL， 每个质量浓度设3 个复孔，药物与细胞作用 24、 48、 72h， 终止培养前 4 h 加入 5 mg/mL的MTT 10 μL/孔， 培养结束后弃上清， 加入 100 μL DMSO振摇 10 min 使结晶充分溶解， 以酶标仪检测 490 nm处各孔吸光度 A值。 取其均值计算药物对细胞增殖抑制率 (%)， 并求其 IC50值， 重复 3次实验。

2.3 体内抗肿瘤作用［9-10］

2.3.1 小鼠肝癌细胞 H22荷瘤小鼠模型制备 H22瘤株经小鼠腹腔传3代以上，取腹部明显膨大小鼠，脱臼处死，酒精消毒，一次性无菌注射器抽取乳白色腹水，置于已灭菌的离心管中，细胞计数器计数， 用生理盐水调整细胞密度至 5 ×106个/mL，每只小鼠右腋下接种 0.2 m L。 小鼠接种瘤细胞24 h后， 随机分为空白组、 模型组、 阳性组 (CTX 20 mg/kg， ip.)、 白 头 翁 皂 苷 D 给 药 组 (3.0、4.5、6.0 mg/kg， ip.)，每组 12 只。空白组及模型组用空白溶媒每天腹腔注射 0.2 mL/只； 阳性对照组腹腔注射环磷酰胺 20 mg/kg， 隔日 1 次； 白头翁皂苷 D(3.0、4.5、6.0mg/kg， ip.)，连续给药10 d， 每天称取小鼠体质量。 最后一次给药后 24 h， 剥离瘤体， 称取瘤质量， 并计算抑瘤率。

2.3.2 肿瘤细胞形态学观察 将各组肿瘤组织放入 10%甲醛液中， 石蜡包埋， 切片并进行 HE染色，光学显微镜下观察并拍照。取各组小鼠肿瘤组织，按电镜标本常规处理，透射电镜观察肿瘤细胞超微结构形态并拍照。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 体外对人肝癌细胞生长抑制作用

经不同质量浓度白头翁皂苷D处理后，人肝癌细胞株 SMMC-7721 细胞的生长受到不同程度的抑制， 并呈浓度、 时间相关。 当白头翁皂苷 D 50 μg/mL时， 作用 SMMC-7721 细胞 24、 48、 72 h 的增殖抑制率分别为 84.26%、 92.12%及 93.48%，其 IC50值 分 别 为 (7.17 ±2.92)、(5.73 ±1.59) 及(6.53 ±1.42) μg/mL。结果见表 1。

表 1 白头翁皂苷 D 对人肝癌细胞 S MMC-7721 增殖的影响 （）Fig.1 Effects of pulsatilla saponin D on human liver cancer cell SMMC-7721 （）

表 1 白头翁皂苷 D 对人肝癌细胞 S MMC-7721 增殖的影响 （）Fig.1 Effects of pulsatilla saponin D on human liver cancer cell SMMC-7721 （）

注:与模型组比较，*P＜0.05；与模型组比较，**P＜0.01

组别质量浓度/ (μg·m L-1) 7721 细胞 A值24 h(增殖抑制率/%)48 h(增殖抑制率/%)72 h(增殖抑制率/%)对照00.741 4 ±0.027 0(0)1.394 4 ±0.481 8(0)2.270 9 ±0.281 5(0)白头翁皂苷 D3.1250.452 6 ±0.074 3*(39.08)0.738 2 ±0.294 1*(46.88)1.256 4 ±0.037 0**(44.27) 6.250.400 5 ±0.128 1**(46.33)0.716 5 ±0.201 4*(47.39)1.176 4 ±0.316 5**(48.48) 12.50.291 8 ±0.039 0**(60.66)0.573 9 ±0.183 9**(58.49)1.087 6 ±0.223 0**(52.38) 250.265 4 ±0.038 8**(64.24)0.433 6 ±0.194 3**(68.88)0.722 9 ±0.286 4**(68.73) 500.117 4 ±0.036 3**(84.26)0.106 8 ±0.026 0**(92.12)0.145 3 ±0.080 8**(93.48) 5-FU250.584 5 ±0.055 9(21.26)0.580 9 ±0.228 9*(58.79)0.205 5 ±0.085 4**(91.14)

3.2 体内抗肿瘤作用

3.2.1 对小鼠肝癌细胞 H22荷瘤的影响 与模型组相比，白头翁皂苷D各个剂量组小鼠瘤质量明显降低 (P＜0.01)； 环磷酰胺组瘤质量也显著减低 (P＜0.01)。 白头翁皂苷 D 4.5、 6.0 mg/kg剂量组 的 抑 瘤 率 分 别 为 38.67%、 41.59%， 阳 性(CTX) 组为 55.59%。 结果见表 2。

表 2 白头翁皂苷 D 对小鼠肝癌细胞 H22荷瘤小鼠的影响（）Tab.2 Effect of Pulsatilla saponin D on H22cells in tumorbearing m ice（）

表 2 白头翁皂苷 D 对小鼠肝癌细胞 H22荷瘤小鼠的影响（）Tab.2 Effect of Pulsatilla saponin D on H22cells in tumorbearing m ice（）

注: 与模型组比较，*P＜0.05； 与模型组比较，**P＜0.01

组别剂量/ (mg·kg-1)体质量/g始末瘤质量/g抑瘤率/%模型-24.6 ±1.4 33.6 ±3.71.767 ±0.726-白头翁皂苷 D3.024.8 ±1.3 28.8 ±2.41.250 ±0.526*29.27 4.524.9 ±1.5 26.8 ±2.41.084 ±0.419**38.67 6.025.1 ±1.5 25.8 ±1.51.032 ±0.460**41.59环磷酰胺(CTX)2024.3 ±1.5 29.7 ±2.70.785 ±0.262**55.59

3.2.2 肿瘤细胞形态学观察 光镜下观察， 模型组肿瘤细胞多呈团灶状分布，有的呈腺样排列，有的沿骨骼肌呈侵袭性生长， 将骨骼肌分离。 CTX组肿瘤细胞呈弥漫性分布，可见大量坏死细胞，细胞正常结构消失。白头翁皂苷D处理组肿瘤细胞呈弥漫性分布，细胞大小不等，形态不规则，细胞核深染、出现异形和固缩，可见肿瘤细胞大量坏死，坏死区周围可见凋亡细胞，且呈剂量依赖关系。结果见图2。

电镜下观察，模型组肿瘤细胞呈圆形，细胞核较大， 结构完整， 核膜清晰，核仁明显；CTX组肿瘤细胞大部分发生崩解、坏死现象，染色质凝集成块，胞质内无明显细胞器结构，呈溶解样改变，可见凋亡小体。白头翁皂苷D给药组肿瘤细胞体积变小，细胞表面微绒毛减少或消失，核异染色质浓缩成块，向核周边凝集，核周间隙增宽，可见凋亡小体。 结果见图3。

4 讨论

图2 HE染色病理切片观察Fig.2 HE staining for pathological observation

图3 透射电镜观察肿瘤细胞超微结构Fig.3 U ltrastructu re of tum or cells was observed under the transm ission electron m icroscope

恶性肿瘤是目前危害人类生命健康的严重疾病之一，据统计，每年全球肝癌发病率位居恶性肿瘤发病率的第 5 位， 死亡率居第 3 位［11］。 而我国每年死于肝癌的人数约为 11万， 占全世界肝癌死亡人数的 45%［12］。 化学治疗一直是临床上治疗肿瘤的主要手段之一，特别是对不适于手术治疗或放射治疗的患者。目前临床上应用的广谱抗肿瘤药物如铂类化合物、长春碱类药物等，往往因较严重的毒副作用而限制了它们的临床应用［13］。 为开发新型抗肿瘤药物，我们对白头翁皂苷D进行较系统的研究。

本次实验的给药剂量是参照本课题组在其它类白头翁单体抗肿瘤实验中的剂量以及前期预试实验的剂量设定， 具体参照本课题组相关专利［14］。 在前期预试实验中，环磷酰胺体内表现出了良好的体内抗肿瘤活性和稳定性。然而，在体外实验中未表现出良好的活性和稳定性， 氟尿嘧啶 (5-FU) 却表现出了很好的稳定性及活性。通过查阅相关文献发现，有的文献报道在体内外实验时采用了不同的阳性药［15-16］。 所以本 次 实 验 分 别 选 择 5-FU、 环 磷酰胺 (CTX) 为体外和体内试验阳性药进行研究。经研究发现， 人肝癌细胞株 SMMC-7721 经3.125 ～50 μg/mL的白头翁皂苷 D处理 24 h、 48 h 及 72 h后，其细胞生长受到不同程度的抑制，表明其对体外肝癌细胞生长有良好的抑制作用且呈剂量依赖性。体内实验结果证实，白头翁皂苷D对小鼠肝癌细胞 H22荷瘤生长有明显的抑制作用， HE染色、电镜显示，白头翁皂苷D给药组肿瘤细胞大量坏死或凋亡，细胞核固缩，细胞核变小，可见凋亡小体等，提示其对肝癌细胞的增殖具有明显抑制作用，作用机制可能与促肿瘤细胞凋亡有关。

本实验为寻找抗肿瘤高效低毒的先导化合物提供理论依据，但其抗肿瘤作用机制及其与荷瘤机体免疫功能之间的关系，尚有待进一步研究。

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Effect of Pulsatilla saponin D on hepatocarcinoma in vivo and in vitro

XU Kun1，2， SHU Zhan1， WANG Yong-lin2， XU Qiong-ming1， YANG Shi-lin1，2， LIU Yan-li1*

(1.Department of Pharmacy， Soochow University， Suzhou 215123， China； 2.Department of Pharmacy， Guiyang University of Medicine， Guiyang 550004， China)

AIM To study the effect of Pulsatilla saponin D from root of Pulsatilla chinensis(Bge.)Regel on human hepatocarcinoma cell line SMMC-7721 in vitro andmouse H22hepatoma carcinoma cell in vivo.M ETHODS In vitro experiments，MTT assay was used to evaluate proliferational inhibition of P.saponin D on SMMC-7721 cells.In vivo experiments， ICR mice were used to establish H22hepatoma carcinoma cell tumor model.The suppression ratio of H22hepatoma carcinoma cell growth was determined.The morphologic and apoptotic body were evaluated by lightmicroscope(HE staining)and electronmicroscope.RESULTS Medication groups showed different levels of SMMC-7721 cells proliferation inhibition after24 h， 48 h， 72 h with P.saponin D.Marked inhibitory effect of Pulsatilla saponin D on the transplanted hepatocellular carcinoma H22was observed in the tumor-bearing mice.The inhibitory rateswere 38.67%and 41.59%respectively at the dose of 4.5 and 6.0 mg/kg P.saponin D， respectively.(P＜0.01 vs.modelgroup).Histopathological examination revealed widespread necrosiswith massive accumulation of infiltrating lymphocytes and plasmacytes in the tumors.Numerous apoptotic cells and apoptotic bodieswere observed in the tumors under the electron microscope.CONCLUSION Pulsatilla saponin D has anti-tumor effects in vivo and in vitro.

Pulsatilla saponin D；liver cancer； anti-tumor； cell proliferation； apoptosis

R966

:A

:1001-1528(2014)02-0240-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.02.005

2013-03-04

重大新药创制国家科技 重大专 项 (2011ZX09102-001-19) ； 国家自 然科学基金 青年基金 (81102818) ； 国家自然 科学 基金(81273402)

徐 坤 (1988—) ， 男， 硕士生， 研究方向: 中药活性成分。 Tel:15185996322 ， E-mail:xukun1633@126.com

*通信作者: 刘艳丽 (1974-) ， 女， 副教授， 研究方向: 中药抗肿瘤。 Tel:(0512)69561421， E-mail:liuyanli@suda.edu.cn