广西莪术水提物对大鼠肝脏胞浆液抗氧化酶和微粒体药物代谢酶的影响

杨秀芬， 石卫州， 程允相， 樊星花

（1.广西中医药大学药学院药理学教研室， 广西 南宁 530001； 2.广西中医药大学第一附属医院药剂科，广西 南宁 530023）

［药 理］

广西莪术水提物对大鼠肝脏胞浆液抗氧化酶和微粒体药物代谢酶的影响

杨秀芬1， 石卫州2， 程允相1， 樊星花1

（1.广西中医药大学药学院药理学教研室， 广西 南宁 530001； 2.广西中医药大学第一附属医院药剂科，广西 南宁 530023）

目的 研究广西莪术水提物对大鼠肝脏胞浆液和微粒体内抗氧化酶和药物代谢酶的影响。方法 用差速离心法制备肝脏胞浆液及微粒体， 测定抗氧化酶和药物代谢酶 NADPH-细胞色素 P-450 还原酶、 CYP3A、 CYP2E1 和谷胱甘肽-S-转移酶 (GST) 和葡萄糖醛酸-转移酶 (UGT) 的活性。 结果 在肝胞浆液， 与空白组比较， 广西莪术各剂量组对超氧化物歧化酶 (SOD) 和谷胱甘肽还原酶 (GR) 水平的影响没有明显差异 (P＞0.05)； 中剂量显著增高过氧化氢酶 (CAT) 活性 (P＜0.01)； 高剂量明显增高 GSH-PX活性 (P＜0.05)。 广西莪术各剂量组对 CYP2E1 和 UGT的活性均没有显著的影响 (P＞0.05)； 均明显增高 GST活性 (P＜0.05)； 低剂量显著降低 NADPH-细胞色素 P-450 还原酶活性 (P＜0.05)， 各剂量组明显降低 CYP3A活性 (P＜0.05)； 苯巴比妥钠组明显增高 CYP3A、 GST和 UGT的活性(P＜0.05)。 结论 广西莪术可能会影响体内药物代谢， 合并用药时， 应考虑潜在的药物间相互作用。

广西莪术；抗氧化酶；药物代谢酶

莪术为姜科植物蓬莪术 Cureuma phaeocaulis Val.、 广西莪术 Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang或 者 温 郁 金 Curcuma wenyujin Y.H. Chen et C.Ling的干燥块茎［1］。 性辛、苦、温，归肝脾经，具有破血行气止痛，积散结，破血祛瘀，行气止痛等功效。近年来研究发现，莪术具有抗肿瘤、 抗病毒、 抗炎镇痛、 抗白血病等作用［1］。 广西莪术为广西产大宗道地中药材，约占莪术市场的60%的份额。本课题主要研究广西莪术对大鼠肝脏抗氧化酶和药物代谢酶的影响，以进一步探讨广西莪术的作用和作用机制，从而指导临床合理用药。

1 验材料和方法

1.1 药品和试剂 广西莪术 rhizomes of Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang于 2011 年 4月26日购于广西钦州市灵山县陆屋镇， 经广西中医药大学药学院中药鉴定教研室何报作教授鉴定为正品。 药物煎煮方法参见文献 ［2］。

谷 胱 甘 肽-过 氧 化 物 酶 (GSH-Px 批 号20110628)、 过氧化氢酶 (CAT批号 20110609)、超氧化物歧化酶 (SOD批号 20110622)、 谷胱甘肽-S-转移酶 (GST批号 20110707) 谷胱甘肽还原酶 (GR批号 20110701) 试剂盒均购自南京建成生物 工 程 研 究 所。 氨 基 比 林 (Sigma-aldrich，1001024266)； Tris( 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷，Sigma，Cat.No.T8060)； NADP+(烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸， Scientific Research special， 004669)； G-6-P(葡萄糖-6-磷酸， Sigma， G7250)； NADP+-G-6-P(Sigma， Cat.No.D8090)；G-6-PDH( 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，Roche， G8020)； Triton X-100( 聚乙二醇辛基苯基 醚， Solarbio， Cat.No.T8200)；维生素 C(Sigma)； UDP-葡萄糖醛酸 ( 尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸，Sigma)； 其他试剂为国产分析纯。

1.2 仪器 台式低速离心机 (北京京立离心机有限公司)； TU-1901 紫外可见分光光度计 (北京普析通用仪器有限责任公司)； 数显恒温水浴锅 HH-8(国华电器有限公司， 型号 HH-2)； 电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)； 酶标仪 (德国 BioTeK公 司)； 96 孔板 (JET BIOFIL)； 冰 箱(SIEM ENS 公司， 型号 KK24T18TI)； 微量加样器(法国 GILSON)； 超低温冰箱 ( 美国 Thermo Forma，型号725)。

1.3 给药方 法［3-5］雄 性 SD大鼠 40 只，体 质 量180 ～220g， SPF级， 合格证号:SCXK2009-0002，由广西医科大学实验动物中心提供。按体质量给药，灌胃给予广西莪术水煎液低、中、高生药给药量均为 0.81、 2.43、 7.29 g/kg， 1 日 1 次，连续 3周， 饲养至第21日， 以等量纯净水为阴性对照组: 1 日 1 次灌胃， 连续 21 d， 饲养至第 21 日。 阳性对照: 饲养方法同阴性对照组，饲养至第 18日，腹腔注射 80mg/kg的苯巴比妥钠， 1 日1 次， 连续4 d。 给药结束后， 大鼠禁食 12 h 后， 断头处死大鼠，分离肝脏，用冰冷的生理盐水充分灌流、洗净至白陶土样，匀浆，4 ℃， 1 000 g， 离心 15 min，取上清液， 于 4 ℃， 12 500 g， 离心两次，每次15min， 取上 清 液 转 移 至 超 速 离 心 管 内， 4 ℃，105 000 g， 离心 1 h， 上清液为胞浆液， 沉淀为微粒体。

1.4 胞浆液抗氧化酶和微粒体 GST活性按试剂盒操作说明进行。

1.5 NADPH-细 胞 色 素 C （ P-450 ） 还 原 酶 的 测定［3］取 2.8 mL磷酸缓冲液，加微粒体蛋白悬液0.1 mL， 加细胞色素 C 0.1 mL，混匀，550 nm处测定吸光度值。测定管中操作步骤同上后，加入NADPH溶液 20 μL， 立即混匀， 秒表计时， 每分钟测定 1 次 OD值， 连续测定 3 min。

1.6 氨基比林-N-脱甲基酶 （CYP3A） 活 性的测定［3-4］配制 0.5 mmol/L甲醛工作液， 取 0、 0.1、0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 1.0 m L工作液， 分别用蒸馏水补充到 1mL。 37 ℃水浴3min， 加入三氯醋酸终止反应，离心 10 min，取上清液 1 mL， 加入Nash 试剂 1 mL， 60 ℃水浴 10 min， 自来水冷却，测定 420 nm处的 OD值。 以系列浓度的甲醛为横坐标，各浓度标准液的OD值为纵坐标进行线性回归，求得甲醛线性回归方程。在测定管中加入微粒体蛋白悬液 0.5 mL， 氨基比林-MgCl2水溶液 0.5 m L， 37 ℃水浴温孵 2 min 后， 加入 NADPH启动反应， 37 ℃水浴 30 min，加入 ZnSO40.35 mL， 冰浴5 min，加 饱 和 Ba(OH)20.35 mL， 混 匀，放 置5 min后离心， 取上清液 1 m L， 其余步骤同甲醛标准曲线制备，依据甲醛标准曲线计算酶活性。

1.7 苯胺-4-羟化酶 （CYP2E1 ） 活性的测定［3-4］配制 10 μmol/L 4-氨基酚工作液， 取此工作液 0、0.2、 0.4、 0.6、 0.8 和 1.0 mL， 用 6%三氯醋酸(TCA) 补充至 1 m L， 加至已盛有 1%苯酚的试管中， 混匀，加入 1 mL 1 mol/L Na2CO3， 室温放置30 min，测定 630 nm波长处吸光度值。以 4-氨基酚浓度为横坐标，OD值为纵坐标，进行线性回归， 求得 4-氨基酚的线性回归方程。 取 0.73 mL NADP+-G-6P Tris缓冲 液 与 0.03 mL盐酸 苯 胺 混合， 37 ℃水浴 2 min， 加微粒体 0.2 mL，37 ℃水浴 30 min， 加入冰冷的 20%三氯醋酸 1 mL终止反应， 离心 15 min， 取上清液 1 mL， 其余步骤同 4-氨基酚标准曲线的制备， 依据 4-氨基酚标准曲线计算酶活性。

1.8 葡萄糖醛酸-转移酶 （UGT） 活性的测定［3］

取辅助因子溶液 1 mL和 0.5 m L(1 mmol/L)2-氨基酚， 加 0.5 mL微粒体蛋白悬液启动反应， 空白管加入 0.5 mL蒸馏水代替 2-氨基酚。37 ℃水浴，振摇温孵 30 min。 加 1 m L冰冷的 20%三氯醋酸，0.1 mL的磷酸缓冲液以终止反应。 冰浴 5 min，3 000 r/min离心 5min， 取上清液 1mL， 加 0.5mL新鲜配制的 0.1% 亚硝酸 钠，混 匀，放 置 2 min。加 0.5 mL 0.5%氨基磺酸胺， 混匀， 放置 3 min，加 0.5 mL 0.1%N-奈乙烯二胺， 混匀， 放置于暗处60 min， 以空白管调零， 540 nm处测定吸光度值。苯胺标准曲线的制备按 “2.4” 项的方法绘制， 然后根据标准曲线计算酶活性。

2 实验结果

2.1 广西莪术对大鼠肝脏胞浆液抗氧化酶活性的影响 与空白组比较， 广西莪术各剂量组对 SOD和GR水平的影响没有明显差异 (P＞0.05)； 中剂量显著增高 catalase(CAT) 活性 (P＜0.01)； 高剂量明显增高 GSH-PX活性 (P＜0.05)(见表 1)。

2.2 广西莪术对大鼠肝微粒体药物代谢酶活性的影响 与空白组比较，广西莪术各剂量组对CYP2E1 和 UGT的活性均没有显著的影响 (P＞0.05)； 均明显增高 GST活性 (P＜0.05)； 低剂量显著 降 低 NADPH-细 胞 色 素 P-450 还 原 酶 活 性(P＜0.05)，各剂量组明显降低 CYP3A活性 (P＜0.05)； 苯巴比妥钠组明显增高 CYP3A、GST和UGT的活性 (P＜0.05)， (见表2)。

表 1 广西莪术对大鼠胞浆液 CAT、 T-SOD、 GSH-Px、 GR和 GST的影响 （） （n=7 ～8）Tab.1 Efffect of aqueous extract of Curcuma kwangsinesis on the activities of drug m etabolizing enzymes in m icrosomes of liver tissues of rats（） （n=7 ～8）

表 1 广西莪术对大鼠胞浆液 CAT、 T-SOD、 GSH-Px、 GR和 GST的影响 （） （n=7 ～8）Tab.1 Efffect of aqueous extract of Curcuma kwangsinesis on the activities of drug m etabolizing enzymes in m icrosomes of liver tissues of rats（） （n=7 ～8）

注:与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组 别剂量/(g·kg-1) CAT /(U·mgprot-1) SOD /(U·mgprot-1) GSH-Px /(活力单位) GR /(U·gprot-1)空白组-271.35 ±51.59250.55 ±33.43346.16 ±34.613.73 ±2.03广西莪术低0.81268.23 ±30.67285.89 ±49.56353.37 ±76.276.80 ±6.44广西莪术中2.43375.57 ±33.54**266.45 ±49.79396.92 ±132.275.64 ±5.22广西莪术高7.29269.94 ±33.56275.87 ±23.87430.38 ±82.63*6.36 ±6.36

表 2 广西莪术对大鼠肝微粒体内 NADPH-细胞色素 P-450 还原酶、 CYP3A、 CYP2E1、 GST和 UGT活性的影响 （）（n=7 ～8）Tab.2 Effect of aqueous extract of Cu rcuma kwangsiensis on the activities of drug metabolizing enzymes in m icrosomes of liver tissues of rats（） （n=7 ～8）

表 2 广西莪术对大鼠肝微粒体内 NADPH-细胞色素 P-450 还原酶、 CYP3A、 CYP2E1、 GST和 UGT活性的影响 （）（n=7 ～8）Tab.2 Effect of aqueous extract of Cu rcuma kwangsiensis on the activities of drug metabolizing enzymes in m icrosomes of liver tissues of rats（） （n=7 ～8）

注:与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组 别剂量/(g·kg-1) P-450 还原酶/(nmol细胞色素C·min-1·mg-1) CYP3A /(nmol· min-1·mg-1) CYP2E1 /(nmol·min-1· mg-1) GST /(U· mgprot-1) UGT /(nmol·min-1· mgprot-1)空白组-0.51 ±0.131.52 ±0.9314.84 ±3.0317.45 ±4.580.13 ±0.03广西莪术低0.810.19 ±0.10*0.61 ±0.80*17.21 ±5.5633.57 ±17.63*0.10 ±0.04广西莪术中2.430.29 ±0.150.42 ±0.67**15.60 ±2.4936.69 ±21.58*0.10 ±0.04广西莪术高7.290.44 ±0.340.27 ±0.33**22.63 ±9.4240.20 ±15.11**0.10 ±0.04阳性组(苯巴比妥)0.08-3.03 ±1.10**-30.63 ±11.92*0.18 ±0.04*

3 讨论

3.1 广西莪术对胞浆液抗氧化酶的影响 抗氧化酶 SOD、 CAT、 GSH-Px等是机体内抗氧化系统的主要组分，其作用是及时清除体内代谢过程中产生的各种自由基、氧化还原产物、过氧化物等。直接或间接保护机体细胞免受自由基、氧化还原产物、过氧化物损伤［6-7］。

本试验研究结果表明，在灌胃给予广西莪术水煎液后，在肝脏胞浆液中，中、高剂量组可不同程度增高 CAT和 GSH-Px的活性， 提示广西莪术在较大剂量时能够增强大鼠肝脏的抗氧化能力。

3.2 广西莪术对药物代谢酶的影响 药物相互作用最常见的原因是药物代谢酶酶的诱导或抑制，中药用药以复方水煎液或单味药材的水煎液为主，一个方剂含有多种中药，一种单味药材的水煎液也可能含有成千上万或更多种成分。因此对中药进行药物代谢酶的研究，有助于阐明中药作用机制及毒副作用发生机制，对临床合理用药具有指导作用。

细胞色素 P450(cytochrome P450， CYP) 是广泛存在于生物体内的一类含血红素和硫羟基的蛋白质， 是一超家族药物代谢酶系［8］。 NADPH-细胞色素 P450 还 原 酶 (NADPH cytochrome P450 reductase， CPR) 是 CYP酶可提供 CYP酶系氧化还原反应所需的第 1个电子，其表达的缺失将抑制CYPP450 酶的活力［9］。 本研究结果发现广西莪术在低、 中剂量时对 CPR活性有明显的降低作用，具体原因有待进一步研究。

CYP3A是肝脏与小肠中含量最为丰富的药物代谢酶， 临床常用药物中亦约有 50%经由 CYP3A代谢［10］。 本实验结果显示， 广西莪术各剂量组明显地抑制大鼠 CYP3A的活性。 临床上当 CYP3A底物类药物如红霉素、他汀类药物、硝苯地平、环孢素等与广西莪术合并用药时，应考虑到可能存在潜在的代谢性药物相互作用。

CYP2E1 在肝 脏中占 肝细胞 色素酶 总量的7%［11］。 CYP2E1 不但参与部分药物的代谢， 而且还能催化许多前致癌物和毒物的活化过程［11］。 本实验结果显示， 广西莪术对 CYP2E1 活性没有明显的影响。

谷胱甘肽 S-转移酶 (GST) 和尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸转移酶 (UGT) 是Ⅱ相主要的药物代谢酶， 主要参与药物的结合代谢， GST催化还原型谷胱甘肽与一系列亲电子化合物结合，对进入体内的亲电子致癌物、外源性毒物起解毒和保护作用［12-13］，UGT催 化大 多 数 药物、 致 癌物、 毒 物 等与葡萄糖醛结合而代谢、 解毒、 排泄［14］。 GST分布于大多数组织，如肝脏、肠道、肾脏、睾丸、肾上腺和肺，其中又以肝脏最多。广西莪术各剂量组对 GST均有明显的诱导作用。 说明广西莪术可加速代谢排出体内毒性化学物质，增加肝脏的解毒能力。本研究显示，与空白组相比，广西莪术对UGT没有明显的影响。

苯巴比妥钠是 CYP3A、 GST和 UGT的经典诱导剂。本实验研究结果同样也显示苯巴比妥钠能显著升高 CYP3A、 GST和 UGT的活性。

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Effect of aqueous extract of Curcuma kwangsiensis rhizom a on liver antioxidant enzymes in cytosols and drugm etabolizing enzym es in m icrosomes in liver of rats

YANG Xiu-fen1， SHIWei-zhou2， CHENG Yun-xiang1， FAN Xing-hua1
(1.Department of Pharmacology， Faculty of Pharmacy， Guangxi University Of Chinese Medicine， Nanning 530001， China； 2.Department of Pharmacy， The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning 530023， China)

AIM To study the effect of aqueous extract of Curcuma kwangsiensis rhizom(ECKR)on liver antioxidant enzymes in cytosols and drug metabolic enzymes in microsomes in liver of rats.MEHTODS Cytosols and microsomes were isolated from liver and prepared by differential centrifugation using the standard procedure. The activities of antioxidant enzymes and drugmetabolic enzymeswere determined by UV-Vis spectrophotometer. RESULTS In cytosols， all dosages of ECKR showed no effecton SOD and GR(P＞0.05)compored to the control group.Medium dosage(2.43 g/kg)significantly increased the activities of catalase(CAT)(P＜0.05) ，and the highest dose sharply increased the activities of GSH-PX(P＜0.05).In microsomes， compared with the control group，all dosages of ECKR had no effecton the activities of CYP2E1， UGT's activities，butallsignificantly increased the activities of GST(P＜0.05).Low dosage(ECKR 0.81 g/kg)decreased the activities of NADPH cytochrome P450 reductase(P＜0.05).All of ECKR groups significantly reduced the activities of CYP3A(P＜0.05).The positive control group(phenobabital)induced the activity of CYP3A， GST and UGT obviously(P＜0.05).CONCLUSION ECKRmay affect drugmetabolism in vivo.There fore， drug-drug interactions should beconsidered when ECRR is used with other drugs.

Curcuma kwangsiensis rhizoma； antioxidant enzymes； drugmetabolic enzymes

R285.5

:A

:1001-1528(2014)02-0221-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.02.001

2013-03-04

国家自然科学基金 (81060353) ； “教育部新世纪优秀人才支持计划人选” 资助项目 ( 教技函 2010-14 号， NCET-10-0093)；广西自然科学基金项目 (2011GXNSFF018006)。

杨秀芬 (1969—)， 男， 医学博士， 教授， 硕士生导师， 研究方向: 活血化瘀类中药对药物代谢酶和抗氧化酶活性的影响。Tel:(0771)2279423， E-mail:xiufenyang@163.com