腺相关病毒Rep78/68蛋白功能的研究进展

占申标吕颖慧，2李招发，2

（1.华侨大学分子药物研究院，泉州 362021；2.分子药物教育部工程研究中心，泉州 362021）

腺相关病毒Rep78/68蛋白功能的研究进展

占申标1吕颖慧1，2李招发1，2

（1.华侨大学分子药物研究院，泉州 362021；2.分子药物教育部工程研究中心，泉州 362021）

Rep78/68是腺相关病毒（AAV）基因组编码的具有多种调控功能的非结构蛋白。主要参与了AAV DNA定点整合到人类19号染色体，抑制病毒的生物活性，如腺病毒、类猿病毒SV40等，调节AAV DNA的复制和转录等。重点阐述了定点整合的作用机制，Rep78/AAV ITR /ICP8复合物的形成机制以及Rep68蛋白的寡聚化特性，Rep78蛋白对p53核输出的限制，AAV Rep78蛋白与人乳头瘤病毒（HPV）E1蛋白相互作用从而促使Rep78和ITR DNA的结合，Rep78对乙型肝炎病毒（HBV）的抑制。这些作用的详细机制仍需完善和充实，对Rep78/68蛋白的相关作用机制的深入研究有助于rAAV基因药物的研发。

AAV Rep78 Rep68 p53 机制

腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）为复制缺陷型病毒，是细小病毒家族的一个成员，具有一系列特征，能将基因组定点整合到人类基因组19号染色体特定区域（19q13.42-qter）：AAVS1［1-3］，并且没有发现与人类疾病有关，是基因治疗的理想载体［4］。AAV的有效感染通常需要辅助病毒的存在，如腺病毒（Ad）、疱疹病毒（herpes virus）和人乳头瘤病毒（HPV）等［5］。AAV基因组为4.7 kb的单链DNA（ss-DNA），两个末端是倒转重复序列（ITR），它是AAV基因组复制和包装所必须的唯一顺式作用元件［6，7］。ITR序列之间包含两个开放阅读框架，称为Rep和Cap，分别编码4个非结构蛋白（Rep78、Rep68、Rep52和Rep40）和3个结构性蛋白（VP1、VP2和VP3）［8］。另外，Cap基因的开放阅读框2还编码装配激活蛋白（AAP）［9-11］。Rep78和Rep68蛋白在AAV的生命周期中扮演着相当重要的角色，这两个蛋白的深入研究，对重组腺相关病毒（rAAV）介导的基因治疗意义深远。基于此，本文主要阐述了Rep78和Rep68蛋白一些相关作用的机制研究。

1 Rep78/68的结构

4个非结构的Rep蛋白分别由p5和p19启动子起始的mRNA通过选择性剪接后翻译而得。Rep78和它的剪接异构体Rep68由p5启动子起始的2种mRNA翻译，Rep52和它的剪接异构体Rep40由p19启动子起始的2种mRNA翻译［12］（图1）。Rep52和Rep40蛋白C末端的氨基酸序列分别与Rep78和Rep68相同。Rep78/Rep68具有ATP酶和螺旋酶的活性结构域。在辅助病毒存在时，两个大的Rep蛋白序列和功能很是相似，Rep78/68蛋白可以和ITR中的特定序列结合。类似的序列在AAV的3个启动子上游也都存在。这两种蛋白对于AAV生活周期的每一时期都是必需的。能够完成一系列复杂的功能，Rep蛋白肯定能与细胞内的一些蛋白，以及辅助病毒的蛋白产生相互作用，迄今为止，对这些相互作用的研究还不是很透彻［13］。

2 Rep78/68协助AAV基因组定点整合

腺相关病毒能将基因组定点整合到人类19号染色体上的特定位点AAVS1（图2）。Surosky等［14］利用PCR技术鉴定得知，在一些特定的细胞中，AAV基因组能整合到AAVS1。通过这个试验发现，无论是顺式或者反式的AAV Rep蛋白，对于定点整合都起着决定性的作用。而且只有两个大的Rep蛋白（Rep78和Rep68）参与了定点整合这一过程。另外，顺式的AAV末端倒转重复序列（ITR）对于定点整合到AAVS1并非必不可少，但可以提高整合的效率。ITR包含一个Rep蛋白结合位点（RBS）和能被Rep蛋白的剪切活性识别的末端决定位点（TRS）［15］，RBS 由串联重复序列的四聚物GAGC组成［14］，Rep78/68可特异识别（GAGC）4DNA序列，这一序列被称为Rep识别序列（RRS），人类的19号染色体AAVS1就存在于RRS序列中。体外的结合试验表明：Rep78/68与AAV DNA结合以及剪切功能在AAV定点整合过程中发挥着很重要的作用，Rep78/68能够调节AAV ITR 和AAVS1上包含RBS和TRS的一段109 bp的序列之间复合物的形成［16］。如果将RRS或TRS序列突变，定点整合就无法进行［17］。其中，可以肯定有许多未知的胞内蛋白也都参与了整合过程，但是至今还没有研究清楚［17-19］。

通过一系列的体外或者体内的试验都可以得到如下的结论：首先，AAV ITR和AAVS1中的RBS在Rep78/68的作用下得以靠近［16，20］；其次，形成Rep介导复合物，并且推测Rep78/68特异剪切ITR和AAVS1的特定位点；最后，以非同源重组的方式进行位点整合［17，21］。

Surosky和Urabe等［14］验证了利用两个质粒来实现定点整合：分别是包含AAV ITR的质粒和AAV Rep蛋白的质粒。这个系统的优点是没有病毒被包装，也就没有整合序列大小的限制，对于基因治疗的发展颇有意义。

虽然Rep78/68对于AAV的定点整合和长期有效表达是必须的，但还无法确定Rep78/68是否仅仅只促进了定点整合这一过程，也许Rep78/68也作用于其他的一些随机整合。由于Rep78/68能够高效的与RBS结合，推测Rep78/68可能促进随机整合或者定点整合于与野生型RBS有一点相似的位点［22］。

Philpott等［23］通过研究发现，AAV ITR不是介导定点整合的必要条件。在Rep78/68存在时，由于138 bp的顺式P5整合效率元件（P5IEE）作用，定点整合依然会发生。为此，又提出最新的定点整合机制：Rep蛋白与AAVS1位点特异结合，发生剪切，出现AAVS1位点的扩增和重排，而且Rep蛋白与AAV P5IEE结合，这样两个模板就相互靠近，在复制时发生置换或重组，定点整合也便得以进行了［24］。

3 Rep78/Rep68调节AAV DNA的复制和转录

3.1 Rep78引导的Rep78/AAV ITR/ICP8三元复合物

的形成

单纯疱疹病毒（HSV）的ICP8蛋白以及UL5/ UL18/UL52的解旋酶-引物酶复合体构成的异源三聚体所形成的4个蛋白复合物参与了AAV DNA的复制［25］。其中，解旋酶UL5和引物酶UL52能够吸引Rep蛋白和AAV基因组，从而起始AAV DNA的复制［26，27］。

Alex等［28-30］通过试验发现：在体外，Rep78的C末端缺失的突变型仍有与ICP8和AAV ss-DNA相互作用的能力，而N末端缺失的突变型在体内没有显示出促使AAV DNA复制的趋势。Rep78的C末端主要包含了核定位信号序列，N末端则有与AAV ITR上RBS定点结合的结构域和内切酶活性。另外，研究表明：Rep78与AAV ITR的直接接触为三元复合物的形成所必需。Rep和ICP8在核复制区域的共区域化依赖于Rep与AAV ITR的结合和解开ITR双链能力。Rep78/68与AAV ITR的RBS结合，解开AAV ITR的双链，牵引ICP8、解旋酶与引物酶复合物以及其他的复制相关因子，然后ICP8迅速与ss-DNA区域结合。这两个进程是否有相互作用至今还无法确定。接下来由于蛋白与蛋白的相互作用，三元复合物得以形成。

3.2 AAV-2 Rep68蛋白的区域连接是寡聚化进程的重要组成部分

AAV的4个Rep蛋白相互协调，共同作用于腺相关病毒生命周期的各个方面：包括转录调节、DNA复制、病毒包装及定点整合。所有的Rep蛋白都有一个SF3超家族解旋酶结构域，在其他的SF3家族中，这一结构域能有效地诱使寡聚化，然而依据AAV Rep蛋白单体的特性，发现AAV Rep蛋白中的解旋酶结构域无法调节稳定的寡聚化［31］。

Zarate-Perez等［31］推测存在一个未知的决定性结构来调节Rep蛋白的寡聚化。通过比较AAV-2 Rep蛋白的解旋酶结构域和其他的SF3家族的解旋酶结构域发现，Rep蛋白解旋酶结构域的小寡聚亚结构存在一个主要结构，与其他的SF3解旋酶结构域有明显的差异。此外，Rep蛋白的解旋酶结构域和自身的起始结合区域（OBD）结合的二级结构预测模型表明有形成α-螺旋的潜力。其中，Rep蛋白的芳香族连接基团（Y224）对寡聚化至关重要，它是SF3解旋酶的保守序列。这个基团的突变明显影响寡聚化作用，并且使产生感染性病毒的能力完全丧失。总之，可以假设一个寡聚化机制模型：在解旋酶结构域折叠形成α-螺旋之前，Y224能够成为解旋酶结构域整体的一部分，对寡聚化至关重要，同时通过与OBD和解旋酶结构域相互合作来对Rep68蛋白的功能发挥重要影响［31］。

AAV-2 Rep68蛋白的区域连接是它的寡聚化进程的一部分，在寡聚化过程中发挥重要的作用［31］。

4 Rep78/Rep68抑制病毒的生物活性以及对辅助病毒的依赖性

4.1 AAV Rep78限制腺病毒E1B55K调节的p53核输出

p53是重要的细胞转录因子，可以抑制癌症的发生［32］，参与细胞周期的循环，当有严重的DNA损伤时能够诱发细胞凋亡［33］。E1B55K蛋白是腺病毒的早期基因产物，能与p53的氨基末端转录调节区结合［34］，形成复合物，从而可以诱使p53从核内转移到细胞质，这样就达到了抑制p53的调节转录效应［35］。其中，E1B55K-p53的相互作用的发生依赖于E1B55K的寡聚化和p53的四聚体化［36］。而AAV能够使p53不被腺病毒影响，这对癌症的治疗起着特殊的意义。研究表明：在腺病毒和AAV共转染的细胞中，Rep78和p53会形成复合物［37］，但是AAV如何影响E1B55K抑制p53相关活性的准确机制还没有弄清楚。Wang等［38］发现AAV-2的Rep78蛋白能抑制腺病毒5型E1B55K调节的p53核输出这一进程，但不能直接影响p53的稳定性，也不能缓解对p53的转录调节活性的抑制作用。

Wang等［38］通过共聚荧光分析发现，当Rep78、E1B55K和p53在H1299细胞中共表达时，Rep78会抑制E1B55K与p53的相互靠近，也能促使E1B55K重新定位。E1B55K具有E3 SUMO1-p53连接酶的功能，可以诱使p53与E1B55K在白血病基因核体（PML-NBs）处共区域化，从而使得p53的核输出得以实现［39］。Rep78 也许能够抑制p53共区域化后的核输出，具体的机制还未弄清。

Rep78蛋白并没有被发现直接影响p53的降解和E1B55K的抑制作用。虽然Rep78也能与p53相结合，但是不能从p53-E1B55K复合物中取代E1B55K。Rep78能够引导p53重新定位于核内，但E1B55K依然与p53共区域化。因此，E1B55K 仍然和p53的氨基末端转录调节区域结合，这也就解释了虽然p53在核内大量积累，但p53的稳定性以及转录调节活性没有增加。也许，p53、E1B55K和Rep78共同表达时能形成三聚体复合物，E1B55K也可能与Rep78结合［13］。

虽然在E1B55K存在下，Rep78不直接影响p53的稳定性或转录调节活性，但能使p53和E1B55K在核内重定位。目前还不清楚是否有其他的作用影响这一过程。Rep78通过限制p53的核输出来抑制腺病毒5型的作用这一新的机制，对我们研究腺病毒这一辅助病毒对AAV的调节有着重大意义［38］。

4.2 AAV Rep78和HPV E1相互作用，促使Rep78和ITR DNA结合

AAV 的相关生命活动需要辅助病毒提供帮助，才能正常进行［40］。如人乳头瘤病毒16型（HPV）E1蛋白对AAV2的生命周期就可提供帮助，可以提高AAV DNA、mRNA，以及一些相关蛋白的表达水平。与AAV Rep78类似，E1是HPV的复制蛋白，但E1没有Rep78的内切酶和共价结合活性。E1和Rep78在体外可以相互作用，利用从细菌中提纯的Rep78和E1蛋白，研究在体外E1蛋白对Rep78与AAV ITR DNA相互作用的影响。E1能够增强Rep78-ITR的结合、ATP酶活、Rep78-ITR的共价连接以及Rep78-ITR的内切酶活性，这种增强作用有明显的剂量依赖关系。然而，E1和Rep78相互作用后的Rep78解旋酶活性明显要比Rep78单独时的解旋酶活性低。研究表明，E1之所以能对AAV的生命周期进行广泛的调节，是由于E1可以增强Rep78与ITR DNA结合至关重要的区域的生化特性［5］。

解旋酶活性改变不是E1蛋白诱发AAV更有效复制的直接机制，在HPV E1存在下，Rep-ITR复合物的相关功能增强，但是E1不能直接与ITR结合。E1蛋白能够增强Rep78 在AAV ITR上的内切酶活性和共价结合能力。因此，可能正是由于这个原因，E1蛋白才能促使Rep78和ITR的结合作用。E1可以增强Rep78在目标DNA上形成寡聚物的能力，多样的Rep78寡聚物与AAV ITR DNA相结合，其中ATP会促进部分的寡聚物形成。而且，E1蛋白也能够增强Rep78蛋白的ATP酶活性。ATP酶活性又会影响解旋酶、内切酶活性以及共价结合。总之，通过增强Rep78的关键位点的生化特性，E1蛋白便可以促进Rep78与ITR DNA的结合，进而对AAV生命周期的相关进程产生重要作用［5］。

4.3 AAV Rep78蛋白抑制乙型肝炎病毒（HBV）

AAV可以抑制人乳头瘤病毒（HPV）、腺病毒、人类免疫缺陷病毒、单纯疱疹病毒和类猿病毒SV40等，1989年首次报道将AAV抑制病毒的作用归结于Rep78蛋白的作用。

刘天会等［41］利用PCR技术扩增HBV-S、C和X基因。通过凝胶电泳阻滞试验（EMSA），可以检测到Rep78蛋白在体外能够与HBV-S、C和X的DNA相结合，并且与HBV-C的结合能力最强，还发现随着Rep78 剂量增多，结合能力更强，呈一定的剂量依赖关系。刘天会等［41］研究表明AAV Rep78蛋白可与HBC-C启动子特异结合，从而下调其转录［42］。因此，可以推测AAV-Rep78抑制HBV DNA复制的机制就是Rep78蛋白结合并抑制了HBV-C基因，这为抗HBV提供了一些新思路，更重要的是可以改善rAAV载体在基因治疗中的应用。

5 展望

Rep78/68在腺相关病毒生命周期中有着很多重要的作用：Rep78/68蛋白的表达对AAV病毒从整合状态的拯救、各种AAV基因的表达和AAV DNA的复制都是必需的。另外，Rep的表达能够抑制腺病毒（Ad）、猿猴病毒40（SV40）、人乳头瘤病毒（HPV）、艾滋病毒（HIV）和疱疹病毒的传播。 Rep 78和Rep68蛋白与AAV基因表达的正负调控有关［4］。总之，Rep78和Rep68蛋白在AAV的生命周期中起着至关重要的作用，虽然我们对其中的一些作用的机理有了一定程度的认识，但许多与Rep蛋白相关的作用的具体机制仍然还需探索。例如，Rep78/68对AAV DNA定点整合到人类19号染色体作用的最合理、最准确的机制还不是很清楚，Rep78抑制的p53-E1B55KHPV 共区域化后的p53核输出的具体机制研究的也不是十分清楚，E1上调的 AAV Rep78蛋白调节复制能力的具体区域，以及具体的生化特性，以及Y224影响Rep蛋白寡聚化详细机理。对Rep蛋白的深入研究有助于AAV的探究，可以促进rAAV介导的基因治疗的发展［43，44］，其意义深远。

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（责任编辑 狄艳红）

Progress in the Research Regarding to the Function of Protein Rep78/68

Zhan Shenbiao1Lü Yinghui1，2Li Zhaofa1，2
（1.Institute of Molecular Medicine，Huaqiao University，Quanzhou 362021；2.Molecular Medicine Engineering Research Center，Ministry of Education，Quanzhou 362021）

Rep78/68, a type of nonstructural proteins encoded by adeno-associated virus（AAV）genome, have a variety of control functions. Rep78/68 promote the integration of AAV DNA site-specific into human chromosome 19, suppress the virus biological activity, such as adenovirus, simian virus 40, adjust the AAV DNA replication and transcription, etc. This paper mainly discusses the mechanism of site-specific integration, the mechanism of Rep78 / AAV ITR/ICP8 complex formation and the characteristics of the oligomerization of Rep68 protein, the limit of the nuclear output of p53 by Rep78 protein, the interaction between AAV Rep78 and human papilloma virus（HPV）E1 protein prompt the combination of Rep78 and ITR DNA, inhibition of the hepatitis B virus（HBV）by Rep78. While the detailed mechanism still remaines to be improved and enriched, further elucidatation of Rep78/68 protein related mechanism may improve the production technology of rAAV and develop gene drug based on rAAV, which has a great significance.

AAV Rep78 Rep68 p53 Mechanism

2013-09-14

国家自然科学青年科学基金项目 （81201183），中央高校基本科研业务费资助项目 （JB-ZR1142）

占申标，男，硕士研究生，研究方向：基因工程；E-mail：1200416004@hqu.edu.cn

李招发，男，博士，副研究员，研究方向：基因工程，生物医学工程；E-mail：lizhaofa@hqu.edu.cn