微生物蛋白质谷氨酰胺酶的初步分离纯化

关静 孙仁强 宋佳雯 黄迪 成楠 岑院汉凤 张扬 陈曦乐赵怡姗 朱晨旦 郑烨 康立 高红亮

（华东师范大学生命科学学院，上海 200241）

微生物蛋白质谷氨酰胺酶的初步分离纯化

关静 孙仁强 宋佳雯 黄迪 成楠 岑院汉凤 张扬 陈曦乐赵怡姗 朱晨旦 郑烨 康立 高红亮

（华东师范大学生命科学学院，上海 200241）

蛋白质谷氨酰胺酶可以特异性地水解蛋白质和多肽的谷氨酰胺残基，研究了产吲哚金黄杆菌产生的微生物蛋白质谷氨酰胺酶的代谢曲线和初步的分离纯化。发酵过程中pH升高，氨浓度增加，到14 h时酶活达到最高为0.359 U/mL。发酵液离心去上清液经3 kD滤膜超滤4倍时，纯化倍数和得率都最高。超滤液加入4倍体积无水乙醇沉淀蛋白质，酶的得率最高为72.7%。沉淀用缓冲液复溶后，经过SP-Sepharose Fast Flow离子交换层析分离，得到单一峰。经过多步纯化后酶得率为31.72%，纯化倍数为124倍，经SDS-PAGE电泳鉴定为单一条带，分子量约为20 kD。

微生物蛋白质谷氨酰胺酶 超滤 乙醇沉淀 离子交换层析 SDS-PAGE

蛋白质谷氨酰胺酶（EC 3.5.1.44）是一种催化水解蛋白质肽链中谷氨酰胺侧链残基中的酰胺基，并释放出氨的酶。蛋白质谷氨酰胺酶在细胞中广泛存在，对蛋白质在转录后的修饰加工过程中起作用，如调节蛋白质的正确折叠，并在蛋白质的肽链断裂和蛋白质老化等生理过程中也发挥作用［1］。许多植物种子的蛋白质中含有较多的谷氨酰胺残基，以给种子发芽提供丰富的氮源，如大豆蛋白、谷物蛋白等。这些植物蛋白在食品工业中有广泛的应用，但是蛋白质中的高谷氨酰胺含量导致了其在弱酸性环境中（大多数食品系统的pH范围）溶解性很低，限制了其应用范围。2000年日本学者Yamaguchi［2］发现了一种由微生物产生的新的脱酰胺基酶，微生物蛋白质谷氨酰胺酶。该酶是由从土壤中分离出一株金黄杆菌Chryseobacterium proteolyticum产生的。Yamaguchi等对该酶进行了分离纯化和酶学性质的研究，其等电点为10，分子量为20 kD左右。该酶仅作用于蛋白质或短肽的谷氨酰胺基团，而对天冬酰胺残基或游离谷氨酰胺没有影响，不会导致蛋白质肽链的交联和水解［1］。Yong等［3，4］用该酶分别脱去部分玉米胶蛋白和小麦蛋白的氨基，其溶解性都得到了提高。用蛋白质谷氨酰胺酶脱去植物蛋白中的谷氨酰胺残基，增加了带有负电荷的羧基，从而降低了蛋白质的等电点，增加了蛋白质在弱酸性环境中的溶解性［1］，同时蛋白质的乳化性、发泡性和凝胶性等都有所增加。因此，在食品行业蛋白质脱氨基作用被认为是一种改善植物蛋白功能特性的好方法［5］。

本实验室从土壤中筛选出了一株产吲哚金黄杆菌（Chryseobacterium indologenes），通过发酵和活性测定，证明其能够产生微生物蛋白质谷氨酰胺酶，进一步通过超滤、乙醇沉淀和离子交换层析，初步分离得到蛋白质谷氨酰胺酶。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 产吲哚金黄杆菌（Chryseobacterium indologenes）华东师范大学微生物实验室分离并保存。

1.1.2 主要试剂 Cbz-Gln-Gly 购自上海西格玛公司；蛋白含量测定试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；乙醇、苯酚、硝普钠等常规试剂为分析纯，购自上海化学试剂公司；大豆蛋白胨、多聚蛋白胨生化纯，购自上海生工生物科技有限公司；酵母提取物，购自安琪酵母有限公司。

1.1.3 培养基 种子培养基（1 000 mL）蛋白胨10 g，酵母提取物2 g，MgSO4·7H2O 1 g，pH7.0；发酵培养基（1 000 mL）乳糖5 g，多聚蛋白胨10 g，Na2HPO4·H2O 1.7 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，KH2PO40.25 g，FeSO4·7H2O 0.05 g，pH7.2。

1.1.4 主要仪器 冷冻离心机（Thermo electron corporation）；恒温调速回旋式摇床（哈尔滨东明医疗器械厂）；超滤仪（Advanced MidJet Lab System，GE Healthcare）；层析系统（AKTA purify，GE Healthcare）；721分光光度计（上海第三分析仪器厂）。

1.2 方法

1.2.1 培养方法 种子培养 取0.6 mL 冻存于-80℃的种子接种于30 mL种子培养基，200 r/min 30℃恒温培养10 h；发酵培养 取培养好的种子以2%接种量接种于发酵培养基，200 r/min 30℃恒温培养，期间取样测定各种参数。分离纯化的发酵液是培养12 h后的发酵液。

1.2.2 发酵液粗酶液的制备 发酵液8 500 r/min，4℃离心15 min，取上清液为酶的粗提液。

1.2.3 蛋白质谷氨酰胺酶的分离纯化

1.2.3.1 酶的超滤 以3 kD的滤膜进行超滤。超滤压力为15 psi，流速为1.67 mL/min。PG酶的分子量约为20 kD［1］，能透过滤膜的为透过液，不能透过的为截留液。

1.2.3.2 乙醇沉淀 以体积比为1∶4（截留液∶无水乙醇）向截留液中缓慢添加无水乙醇（-20℃预冷），-20℃静置1 h。

1.2.3.3 沉淀复溶 乙醇沉淀后的样品8 500 r/min，4℃冷冻离心去上清，沉淀用pH6.5的PBS缓冲液复溶。

1.2.3.4 离子交换层析 复溶后的样品经过0.22 μm滤膜过滤后用SP-Sepharose Fast Flow离子交换树脂进行层析，起始缓冲液为20 mmol/L pH值为6.5的PBS缓冲液，洗脱液为20 mmol/L pH值为6.5的PBS缓冲液中加入1 mol/L NaCl溶液。洗脱速度2 mL/min起始NaCl浓度为0 mol/L，终点NaCl浓度为0.25 mol/L，洗脱10个柱体积，根据A280来收集含蛋白的吸收峰。

1.2.4 SDS-PAGE电泳 采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，浓缩胶浓度为4%，分离胶浓度10%，分别取80 μL样品于1 mL离心管中，加入20 μL样品缓冲液，沸水浴加热5 min。用微量移液枪加样，每孔加样20 μL。

1.2.5 酶活测定方法［2］100 μL底物溶液（含有10 mmol/L Cbz-Gln-Gly和175.6 mmol/L磷酸钠的缓冲液）与10 μL酶液混合均匀，37℃温浴30 min，然后加入100 μL 12%的三氯乙酸终止反应。对照反应是先加入三氯乙酸后再加入酶液。18 000 g 离心5 min。上清液中释放的氨用卢玉棋［6］的方法检测。酶活单位定义为：上述条件下每分钟释放1 μmol氨的量为一个酶活单位。

1.2.6 蛋白含量测定方法 采用碧云天生物技术有限公司试剂盒，以牛血清白蛋白为标准蛋白，按照说明书的方法进行测定。

2 结果

2.1 蛋白质谷氨酰胺酶发酵生产的代谢曲线

试验首先分析了产吲哚金黄杆菌生长代谢规律。从图1可以看出，该菌延滞期较短，接种4 h后进入对数期，12 h后进入稳定期，最终发酵液OD600可达到2.0。发酵液的pH值随着发酵时间的延长不断升高，18 h时pH值达到最高8.6。发酵液中氨增加的趋势和pH升高的趋势基本一致，这是因为发酵液中的蛋白质谷氨酰胺酶分解蛋白质产生氨，氨浓度不断增加，同时也导致了pH值不断升高。蛋白质谷氨酰胺酶的酶活随着发酵时间延长而增加，到14 h达到最大0.359 U/mL，随后酶活略有下降。

2.2 纯化条件的优化

2.2.1 超滤浓缩倍数的优化 发酵液离心后，取上清液为粗酶液，用3 kD的超滤膜，以不同的浓缩倍数对粗酶液进行超滤。由表1可以看出，粗酶液经超滤浓缩4倍后，得率、比活和纯化倍数均最高，比活为0.519 U/mg，纯化了2.65倍，纯化效果最好。因此超滤粗酶液过程中，采取浓缩4倍为最佳条件。

2.2.2 乙醇沉淀比例的优化 分别按不同体积比向超滤后的截留液中加入预冷的无水乙醇进行沉淀，以未加入无水乙醇的截留液的相对酶活为100%，相对酶活为沉淀复溶后酶液的总酶活占截留液总酶活的百分比。由图2可知，当截留液和无水乙醇的体积比为1∶4时，蛋白质谷氨酰胺酶的相对酶活最高，为72.73%，表明酶沉淀较为完全，因此1∶4的体积比为最佳沉淀比例。

2.3 离子交换层析

对乙醇沉淀复溶液进行洗脱，随着NaCl浓度的升高，电导也随之升高，结合在层析柱上的蛋白随之被不断洗下来，最终得到单一的洗脱峰。蛋白浓度（OD280nm）在第5管收集组分的位置达到最高，为52.12 mAU，与此相对应的第5管收集的酶活也达到最高，为18.03 U/mL（图3）。在峰尖位置，电导达到7.40 mS/cm。

2.4 PG酶的分离纯化结果

经过上述步骤初步分离得到PG酶，由表2可知，纯化后的酶，最终得率为31.72%，纯化了124.26倍。

2.4 纯化产物的鉴定

粗酶液经超滤和乙醇沉淀复溶后的样品经SDSPAGE电泳鉴定，电泳结果如图4所示，粗酶液中蛋白质谷氨酰胺酶的位置20 kD几乎没有条带，经过超滤和乙醇沉淀后，该条带非常明显。

离子交换层析样品到SDS-PAGE图谱如图5。穿透峰中有多种蛋白质，而在收集峰中20 kD位置明显的有一个条带。交换纯化后比活为8.843 U/mg。

3 讨论

脱氨基是一种提高植物蛋白食品功能性的最有价值的方法之一，脱氨后可以使蛋白质的溶解性、乳化性、发泡性和凝胶性增加［2］，但化学脱氨基法会引起蛋白质肽链断裂，导致蛋白质水解而失去功能特性。酶法脱氨比化学法更为理想，底物专一性强，反应条件温和，而且安全性高。对蛋白质脱氨的酶目前报道比较多主要有谷氨酰胺转胺酶［7］、蛋白酶［8］、肽谷氨酰胺酶［9］和蛋白质谷氨酰胺酶。谷氨酰胺转胺酶和蛋白酶的主要酶促反应都不是谷氨酰胺的脱氨基作用，用于植物蛋白脱氨时会有副作用，并给食品带来不利的影响。肽谷氨酰胺酶虽然可以专一性的脱氨，但是仅以多肽为底物进行反应，对大分子量的蛋白质没有作用［9］。微生物蛋白质谷氨酰胺酶可以专一性的催化蛋白质或多肽中的谷氨酰胺残基脱氨，并且不具有蛋白酶和谷氨酰胺转胺酶活性，因此应用前景非常广泛［1］，并应用于α-玉米蛋白［3］、小麦蛋［4］和大豆蛋白［10］，还有乳清蛋白［11］和脱脂牛奶［12］等。

目前国内外对微生物蛋白质谷氨酰胺酶的分离纯化报道较少，仅有Yamaguchi等［1］报道把Chryseobacterium proteolyticum发酵上清液超滤，经NaCl沉淀，Phenyl-Sepharose疏水层析，Sepcharyl S-100凝胶过滤层析后，酶最终纯化了153倍，得率为30%，经SDS-PAGE电泳鉴定为单一条带。本研究收集产吲哚金黄杆菌的发酵上清液，经过超滤、无水乙醇沉淀、缓冲液复溶后，经过SPSepharose Fast Flow离子交换层析分离，得到一个单峰，纯化后的酶的得率为31.72%，纯化倍数为124倍。经SDS-PAGE电泳鉴定为单一条带，分子量约为20 kD，这一研究结果与Yamaguchi［1］报道相似。Yamaguchi分离纯化最后一步通过Sephacryl S-100得到26.2 U/mg，本文最后一步离子交换纯化后比活为8.843 U/mg。

4 结论

通过超滤、无水乙醇沉淀、缓冲液复溶、离子交换层析等步骤，对发酵液中微生物蛋白质谷氨酰胺酶进行了初步分离纯化，最终得到纯酶，纯化后的酶的得率为31.72%，纯化倍数为124倍。

［1］ Yamaguchi S, Jeenes DJ, Archer DB. Protein-glutaminase from Chryseobacterium proteolyticum, an enzyme that deamidates glutaminyl residues in proteins：purification, characterization and gene cloning［J］. Eur J Biochem, 2001, 268：1410-1421.

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（责任编辑 李楠）

Extraction and Purification of Microbial Protein—Glutaminase

Guan Jing Sun Renqiang Song Jiawen Huang Di Cheng Nan Ceng yuan Hanfeng Zhang Yang Chen Xiyue Zhao Yishan Zhu Chendan Zheng Ye Kang Li Gao Hongliang
（School of Life Science，East China Normal University，Shanghai 200241）

Protein glutaminase（PG）is an enzyme that catalyzes the specific hydrolysis of glutaminyl residues in proteins and peptide. The metabolic pattern ofChryseobacterium indologenesin PG synthesis and primary purification of PG were studied. The pH value and ammonia concentration increased during the fermentation. The maximal PG activity reached 0.359 U/mL for 14 hours culture. The efficiency of purification and yield of PG were maximal when culture borth was centrifuged and the supernatant was concentrated for four times by ultrafiltration with 3 kD cut-off membrane. Ultrafiltrate was precipitated by 4 times volumes ethanol and the maximal yield of PG was 72.7%. Precipitated PG by ethanol was dissolved in PBS buffer and further purified by SP-Sepharose Fast Flow ion-exchange chromatography. A single peak was got in elution profile. The final yield of PG was 31.72% and the PG was purified 124 times after multiple purification steps. The purified sample contained a single band in SDS-PAGE and corresponding molecular weight was about 20 kD.

Microbial protein glutaminase Ultrafiltration Ethanol precipitation Ion-exchange chromatography SDS-PAGE

2013-08-01

自然科学基金项目（81072422），国家大学生创新创业训练计划项目（1310269039），上海市大学生创新基金项目（KY2012-60S）

关静，女，研究方向：食品微生物；E-mail：k378897850@163.com

高红亮，副教授，研究方向：微生物学，食品化学、食品添加剂；E-mail：hlgao@bio.ecnu.edu.cn