沙根骨中碳酸钙矿化微生物分离筛选及鉴定

胡伟莲 戴德慧

（浙江科技学院 生物与化学工程学院，杭州 310023）

沙根骨中碳酸钙矿化微生物分离筛选及鉴定

胡伟莲 戴德慧

（浙江科技学院 生物与化学工程学院，杭州 310023）

沙根骨（自命名）是在宁夏中卫地区发现的以碳酸钙为主的胶结物质将周围的沙子凝聚在一起形管状物。对沙根骨中碳酸钙矿化微生物进行了分离筛选，共分离到12株菌株，其中3#菌株有较强碳酸钙矿化能力，在经1.0% CaCl2液体培养基中振荡培养的72 h后，能形成矿物沉淀并形成薄膜挂壁。沉淀物质经扫描电镜（SEM）及X射线粉末衍射（XRD）分析，确定为方解石和球霞石混合晶型的碳酸钙晶体。根据其形态特征、生理生化以及16S rDNA对3#菌株进行了鉴定，初步认定了该菌为类芽孢杆菌属，命名为Paenibacillussp.s3，为进一步研究沙根骨的形成机理奠定了良好基础。

沙根骨 生物矿化 微生物 类芽孢杆菌属

生物矿化是指在生物体中细胞的参与下，无机元素从环境中选择性地沉析在特定的有机质上而形成矿物的过程［1］。生物体的矿化过程十分复杂，至今远未充分认识生物矿物的形成机理以及基质、细胞等对生物矿物的调控作用。大多数的研究只是在生物体外简单的模拟体系中进行，并且对生物大分子协同调控作用的研究非常少［2-6］。因此需要在更接近生物体内环境的条件下，进一步研究基质中的生物矿化过程、细胞与矿物的相互作用，以阐明生物矿物的形成过程，为开发仿生材料提供理论基础。但目前生物矿化研究的对象主要为一些多细胞动物（如软体动物、甲壳动物、脊椎动物等），调控及矿化过程过于复杂［7，8］，在无机物矿化的机理研究中难以突破，而在微生物生物矿化方面的研究也只是集中在地质的演变、矿物形成、微生物浸矿等方面的研究［9，10］，对于微生物矿化的种群生态、微观机理、微生物活体与无机物的相互作用机制、微生物活体诱导无机物矿化的机理等方面研究相对较少。笔者在宁夏回族自治区沙漠地区发现少许有沙子黏结的细长管状物（命名为沙根骨），管内中空。在该地区距地表30-60 cm以下发现内部充填着的褐色物质的沙管（图1），对沙管及沙管中褐色物进行了显微观察及初步研究，发现该沙管是由沙子通过由碳酸钙为主要胶结物质集聚而成的（图2）。微生物矿化作用形成沙根骨现象在国内外文献均未见报道。对其形成的机制研究具有原创性。本研究对沙根骨中微生物进行了分离、筛选及鉴定，为今后进一步研究沙根骨矿化微生物及生物矿化形成的机制研究奠定了良好的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 沙根骨样品来源 沙根骨：样品采自宁夏回族自治区中卫地区。在采样过程中，首先用铲子铲去表面的沙子，找到沙根骨，小心采集不短于20 cm的沙根骨，4℃保存备用，在运输及保存过程中注意防止污染。

1.1.2 主要试剂和仪器 琼脂糖：BBI；DNA Ladder Mix maker SM0337（100-10000，上海生工）；Bacterial DNA Kit：SK1201（上海生工）；其他试剂均为分析纯。水平槽电泳仪：DYC P-31DN（六一仪器厂，北京）；凝胶成像仪：FR980（上海复日科技仪器有限公司，上海）；高速冷冻离心机：HC-2518R（BBI美国）；超净工作台：SW-CJ-2FD 型（苏州净化设备有限公司，苏州）：光 学 显 微 镜：BA210（Motick中国）。热场发射扫描电子显微镜：SIRION（FEI公司 荷兰）；X射线衍射仪 X'Pert PRO（PANalytical 荷兰）。

1.1.3 主要培养基 （1）细菌筛选分离培养基（%）：牛肉膏 0.5，蛋白胨0.5，氯化钠 0.3，采样地沙子10，琼脂 2，pH7.4-7.6。（2）真菌筛选培养基（%）：硝酸钠0.3，蔗糖 3，采样地沙子 10，琼脂 2，pH 自然。（3）放线菌筛选培养基（%）：可溶性淀粉2，KNO30.1，采样地沙子10，琼脂 2，pH7.4-7.6。（4）沙子培养基：采样地沙子 20，琼脂 2，pH自然。（5）液体矿化培养基：分别在牛肉膏蛋白胨细菌培养基，察氏培养基，高氏一号液体培养基的基础上添加1.0% CaCl2。121℃灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 沙根骨中微生物的分离、纯化 将新采集的沙根骨在无菌室中用无菌水冲洗去表面沙子及污物，以75%酒精进行表面消毒，用无菌水冲洗，将消毒后的沙根骨用无菌接种针将管内物推入到无菌生理盐水中，并涂布到细菌、真菌、放线菌等分离培养基，分别至于26℃培养一定的时间，观察生长情况。当出现单菌落后进一步划线纯化后斜面保藏。

1.2.2 碳酸钙矿化微生物筛选 将斜面保存的各菌株斜面活化后，加入无菌水将菌体洗下制成菌悬液，按菌种类别分别接入装有1.0 % CaCl2的发酵培养基中（300 mL三角瓶装量50 mL）。置于26℃中180 r/min振荡培养3-8 d，观察发酵液中菌体生长、沉淀以及瓶壁挂膜等情况。

1.2.3 分析检测 用滤纸抽滤去除发酵液和菌体细胞，所得沉淀用蒸馏水冲洗4-5次，洗去表面附着的发酵液，105℃干燥至恒重。对沉淀物质进行扫描电子显微镜及X射线衍射分析。

1.2.4 菌株鉴定 菌体形态观察、生理生化反应及菌种全自动鉴定：选取碳酸钙矿化能力最强的3#菌株，按参考文献方法［11］观察菌体形态并进行生理生化试验。

16S rDNA 分子生物学法鉴定菌种：用UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取菌种的基因组DNA，利用16S rDNA通用引物，上游引物为（5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'），下 游 引 物 为（5'-AGGAGGTGA TCCAGCCGCA-3'）。进行PCR扩增。PCR扩增程序：98℃预变性3 min，98℃维持25 s，55℃维持25 s，72℃1 min，30个循环。PCR 产物检测：预先制备质量分数为 1.0%的琼脂糖凝胶，扩增反应完毕后，取 5 μL PCR 产物与上样缓冲液混合，加样于琼脂糖凝胶点样孔中进行电泳。DNA回收：从琼脂糖中回收DNA，具体方法参照凝胶回收试剂盒说明书。测序：由生工上海生物工程有限公司代作测序。

系统进化树构建：将目的菌株的16S rDNA基因序列输入到GenBank基因数据库（http：//www.ncbi. nlm.nih.gov/genbank）中使用 Blast软件进行序列同源性比较分析。选取同源性高的序列先通过Clustal W软件进行程序进行多重对比后，利用MEGA 5.2软件计算并构建系统进化树［12，13］。

2 结果

2.1 沙根骨中菌株的分离与筛选

通过对沙根骨管腔内的褐色物质进行分离纯化，共得到菌落形态或菌株形态有差异的菌株12株，其中细菌8株，均为革兰氏阳性菌；放线菌2株，丝状真菌2株。将分离纯化得到12株菌株按菌种类别分别接入到筛选培养基中，根据菌株生长情况培养3-8 d。在发酵过程中，能使瓶壁挂上一层沉淀薄膜（图3）和过滤后得到沉淀（图4）的菌株有2株，分别为3#和6#菌株，其产生的沉淀分别为0.8 g/L和 0.07 g/L。由此可以初步判断3#和6#均有一定的生物矿化能力，其中3#生物矿化能力最强，有可能是沙根骨中的晶体形成的主要微生物。对3#菌株的沉淀物质及种属鉴定进行了进一步研究。

2.2 沉淀物质分析

为了定性分析所得沉淀物质，对样品进行了X射线衍射和扫描电镜观察分析。

如图 5所示，沉淀粉末样品进行XRD分析。对照设备所带数据库及PDF 标准卡（PDF No：00-005-0586、No：00-033-0268）的有关数据，沉淀样品出现方解石衍射峰，衍射角＝23.0o、29.4o、35.9o、39.5o、43.1o、47.5o、48.5o分别对应（012）、（104）、（110）、（113）、（202）、（018）、（116）晶面。此外还出现球霞石衍射峰，衍射角22θ＝21.0o、24.9o、27.0o、32.7o、42.7o、43.8o、49.0o、50.0o分别对应（004）、（110）、（112）、（114）、（008）、（300）、（304）、（118）晶面。说明沉淀样品晶型是方解石和球霞石混合晶型。根据两种晶型的衍射峰的强度经计算分析［14］，两者的比例约为52∶48。

由图6可以看出CaCO3颗粒呈分散状态，形貌呈球形、方形和无规则块状体，分布杂乱无章，表面具有多层重叠结构特征，粒径在0-15 μm，沉淀的样品表面无明显菌体印痕。可能菌体本身未参加CaCO3的生物矿化形成。

2.3 菌株鉴定结果

2.3.1 菌株的形态特征及生理生化特性鉴定 3#菌株形态特征见图7。3#菌株在蛋白胨牛肉膏固体培养基上28℃培养48 h 后即形成明显的单菌落，菌落为无色透明，圆形，边缘整齐，表面光滑，粘稠。菌株革兰氏染色为阳性，但随培养时间增长菌体革兰氏染色转为红色，两端钝圆，散生，运动，有较大荚膜，膨大胞囊内有接近顶端的椭圆形大芽孢。生理生化特征：接触酶为阳性、氧化酶弱阳性、水解淀粉、脲酶阴性、VP阴性，不产硫化氢。

2.3.2 分子生物学鉴定及系统发育树构建 3#菌株16S rDNA经PCR扩增后得到约1 500 kb的DNA片段，回收纯化后进行序列测定，序列总长为1 458 bp。将该序列在GenBank中提交（序列号KF669895）并进行同源性检索，结果显示在最相近的序列中，均为类芽孢杆菌属（Paenibacillus）细菌。根据序列在NCBI数据库BLAST，从中选出14个具有代表性的菌株，根据其相近的菌株的16S rDNA序列，利用MEGA5.2构建系统进化树，如图8所示。从系统发育树上看，3#菌株与Paenibacillus castaneae位于同一分枝，同源性最高，亲缘关系最近。从分子生物学鉴定结果分析该菌株可以判定为类芽孢杆菌属，命名为Paenibacillussp. S3，但其种的确定还需通过模式菌进一步比对。

3 讨论

方解石、文石及球霰石等3 种同质多象变体碳酸钙是自然界分布最广的矿物之一，微生物诱导碳酸钙生物矿化一直是地质微生物学领域研究的重要内容［16-19］。矿化微生物通过其自身的新陈代谢，与周围环境介质之间不断发生酶化作用，形成胶结物质——方解石，经过长期的累积，可以将刚沉积的疏松碎屑物质最终胶结形成坚硬的岩石［20］。本研究所采取的样品沙根骨即是微生物通过自身的代谢反应形成以碳酸钙为主的胶结物质将周围的沙子凝聚在一起形成沙管的形态，在恶劣的环境中对沙管中的微生物起保护作用。分离筛选得到碳酸盐矿化微生物是研究沙根骨形成机制的前提条件。本研究通过对沙根骨中的微生物分离、纯化及筛选得到一株碳酸钙矿化微生物。在CaCl2培养基中能将Ca2+形成方解石、球霰石的混合晶型的碳酸钙晶体，经形态、生理生化及分子生物学等方法确定了该菌株为类芽孢杆菌（Paenibacillussp.）。为今后进一步研究沙根骨生物矿化机理方面的基础研究提供材料。此外，若为该菌株提供适宜的环境条件，加速其酶化作用，快速沉积制备出 CaCO3，在较短时间内将石质材料胶结起来，可以为重大建筑工程、重要历史建筑物裂缝以及石质历史文物的修补提供新的方法和思路。

4 结论

从沙根骨中分离得到具有有较强碳酸钙矿化能力的3#菌株，其矿化物经扫描电镜（SEM）及X射线粉末衍射（XRD）分析，确定为方解石和球霞石混合晶型的碳酸钙晶体。通过从形态特征、生理生化以及16S rDNA等方面的鉴定，初步确定了该菌为类芽孢杆菌属，命名为Paenibacillussp.s3.。

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（责任编辑 李楠）

The Isolation，Screening and Identification of CaCO3Mineralization Strain from Sand Boon

Hu Weilian Dai Dehui
（Department of Biology and Chemical Engineering，Zhejiang Universtity of Science and Technology，Hangzhou 310023）

Sand bone（named by the research team）is a tube that is agglutinated by sand with cementing material mainly composed of calcium carbonate. It was found in Zhongwei area of Ningxia Autonomous Region. Strain 3# has strong ability of CaCO3mineralization among 12 strains isolated from sand bone. Mineral deposit was produced and covered the flask wall after 72 h shake cultivation with 1.0% CaCl2liquid medium. To analyze the mineral deposits, XRD and SEM were performed. The result was showed that mineral deposit was made up of calcium carbonate, which contains two crystal forms（calcite and vaterite）. Based on morphological, physiological and biochemical properties and 16S rDNA sequence analysis, strain 3# was identified asPaenibacillussp., and was namedPaenibacillussp. s3 . It laid a good foundation for reaching formation mechanism of sand boon further.

Sand boon Biomineralization MicroorganismPaenibacillus

2013-09-03

浙江省自然科学基金资助项目（LY12C01004 ）

胡伟莲，女，博士，副教授，研究方向：微生物生物技术；E-mail：weilian89@126.com