人内皮素受体A基因克隆及表达

潘晓菲时丽丽谭初兵吕超君徐为人汤立达

（1.天津医科大学基础医学院，天津 300070；2.天津药物研究院 天津市新药设计与发现重点实验室，天津 300193）

人内皮素受体A基因克隆及表达

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（1.天津医科大学基础医学院，天津 300070；2.天津药物研究院 天津市新药设计与发现重点实验室，天津 300193）

为了建立内皮素受体拮抗剂筛选系统，克隆人ETA基因，构建真核表达载体，并实现pTag-Lite SNAP-ETA在CHOK1细胞中的瞬时表达。从人肺腺癌细胞系A549中克隆人ETA基因，连接到pTag-Lite SNAP质粒，构建表达载体pTag-Lite SNAPETA，用FuGENERHD转染试剂将表达载体pTag-Lite SNAP-ETA转染入CHO-K1细胞内，通过荧光显微镜检测融合蛋白SNAP-ETA的表达。DNA测序结果表明pTag-Lite SNAP-ETA表达载体构建成功，荧光显微镜检测结果表明人ETA在CHO-K1细胞中有效表达。

内皮素受体A RT-PCR pTag-Lite SNAP载体 CHO-K1细胞 表达

内皮素（Endothelin，ET）是一种含有21个氨基酸的多肽，是目前已知的作用最强和效应最持久的血管活性肽，有强烈的血管收缩和促平滑肌细胞迁移、增殖作用，广泛作用于体内多系统，有ET-1、ET-2、ET-3三种亚型，与高血压、充血性心力衰竭、糖尿病、癌症及纤维化等有着密切联系。内皮素主要通过与靶细胞膜上的内皮素受体（Endothelin receptor，ETR）结合后发挥其生物学效应，并在心血管疾病、肾脏疾病、糖尿病、自身免疫性疾病和肿瘤等众多疾病的发生发展中扮演了重要的角色，因此拮抗ET与ETR的相互作用被认为是治疗此类疾病的有效治疗途径，而抑制ETR是阻断ET生理病理学效应的主要手段［1-9］。人的ETR分为ETA和ETB两亚型，均为G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor，GPCR），但两者功能存在差异。ETA被认为是基本的缩血管和促生长受体，ETB在血管系统中抑制细胞生长和血管收缩，因其参与ET-1的清除被称为“清除受体”。内皮素及其受体多样性地广泛分布于各组织，通过不同的亚型和信号传递系统介导复杂的生物学效应，与多种心血管系统疾病和糖尿病等有密切联系［10-13］，其中ETA发挥的作用为主要［14，15］。本研究从人肺腺癌细胞A549中克隆了人ETA基因，将其导入pTag-Lite SNAP质粒中，获得重组pTag-Lite SNAP-ETA载体，再将其转染至CHO-K1细胞内，使SNAP-ETA融合蛋白得以表达，为后期ETA的体外研究以及拮抗剂的筛选、活性评价等奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞及质粒 人肺腺癌细胞系A549和中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1场购于中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心，细胞在37℃、5% CO2、饱和湿度下用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养；pTag-Lite SNAP质粒（Tag-liteTMSNAP-plasmid）由中国医学科学院药物研究所国家药物筛选中心馈赠。

1.1.2 试剂 限制性核酸内切酶、primerSTARHSDNA聚合酶、T4DNA连接酶和DNA Marker均购自大连宝生物公司（日本TaKaRa公司）；PCR纯化试剂盒和凝胶回收试剂盒购自北京原平皓生物技术有限公司；PrimeScript 1ststrand cDNA synthesis Kit、大肠杆菌Top10感受态细胞和无内毒素质粒提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；引物由华大基因科技服务有限公司合成；Trizol，胰蛋白酶购自天津市联星生物技术有限公司；FuGENE® HD Transfection Reagent购自美国Promega公司；SNAPCell Fluorescein购于美国NEB公司；其他均为国产或进口分析纯。

1.1.3 培养基 大肠杆菌培养基：蛋白胨、酵母提取物和琼脂粉购自美国Oxoid公司，固体培养基中添加1.5%的琼脂；细胞培养基：DMEM 培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 Trizol法提取总RNA 选取生长态势良好的A549细胞，用Trizol法提取总RNA，将提取总RNA加入紫外板，稀释后酶标仪测定OD260/ OD280，确定总RNA的纯度及浓度。

1.2.2 RT-PCR扩增ETAcDNA 以上述提取的细胞总RNA为模板，按照PrimeScript 1ststrand cDNA synthesis Kit使用说明书进行cDNA逆转录，逆转录条件为37℃，60 min；1%琼脂糖凝胶电泳检测逆转录结果，置-20℃储存备用。

1.2.3 扩增ETA基因 根据GenBank公布的人ETA（NM_001957.3）基因序列，使用Oligo软件，设计扩增ETA的引物（表1）。以前期获得的cDNA为模板，分别扩增ETA基因片段，反应条件为98℃，2 min；98℃，10 s；68℃，80 s；30个循环后72℃，10 min；4℃储存，1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。

1.2.4 构建pTag-Lite SNAP-ETA表达载体 对提取的pTag-Lite SNAP质粒和回收的ETA基因片段，进行ApaI和XhoI双酶切；切胶回收酶切产物，按载体与片段1：5的摩尔浓度，T4连接酶22℃连接2 h；连接产物转化感受态E.coliTOP10，利用氨苄霉素进行抗生素筛选转化子；通过ApaI和XhoI双酶切及菌落PCR鉴定质粒，挑取阳性质粒送测序，获取重组表达载体SANP-ETA，构建流程如图1所示。

1.2.5 定点突变ETA基因 经数次基因测序鉴定，从A549细胞系获得的ETA基因在第343（G-A）、964（C-A）、1 225（A-G）位点有3处突变，根据测序结果设计定点突变引物（表1）。定点突变PCR条件：94℃，3 min；98℃，10 s；50℃，5 s；72℃，8 min；30个循环后72℃，10 min；4℃储存。T4连接酶连接纯化后的PCR产物，DpnI酶切去除模板质粒，转化入E. coliTOP10感受态细胞中，涂布在含有氨苄筛选抗性的固体培养板上，选取几株摇菌送测序（由北京六合华大基因科技股份有限公司测序鉴定），依次将3个位点全部突变回正常的基因序列。

1.2.6 提取pTag-Lite SNAP-ETA无内毒素质粒 分别接种TOP10：pTag-Lite SANP-ETA菌株，37℃，200 r/min，过夜培养；收集菌体，按照天根无内毒素质粒大提试剂盒使用说明书操作，提取pTag-Lite SNAP-ETA无内毒素质粒。将提取质粒加入紫外板，酶标仪测定OD260/ OD280，确定质粒纯度与浓度。

1.2.7 转染CHO-K1细胞 培养生长态势良好的CHO-K1细胞，待其融合度为80%-90%时用胰酶消化成单细胞悬液，按每孔4×104细胞密度接种于96孔板内；待细胞生长至融合度80%-90%时，依据FuGENE® HD说明书进行操作，将pTag-Lite SNAPETA质粒分别瞬时转染到CHO-K1细胞内，37℃，5% CO2条件下继续培养24 h。

1.2.8 荧光显微镜检测SNAP-ETA融合蛋白表达 转染24 h后，弃原培养基，用含5 μmol/L SNAP-tag底物的细胞培养基在37℃，5% CO2条件下继续培养30 min。用无血清细胞培养基冲洗细胞3次，再用无血清培养基孵育30 min，弃掉培养基，在倒置荧光显微镜下拍照，激发波长为500 nm，发射波长为532 nm。

2 结果

2.1 总RNA的提取

从人肺癌细胞A549中提取总RNA，测定的OD260/OD280值位于1.8-2.0之间，说明所提取的RNA纯度较高，无DNA和蛋白污染。经过琼脂糖凝胶电泳验证（图2），显示提取的总RNA无杂带，未见明显降解，也无DNA污染，总RNA完整性较好。

2.2 人ETA基因的克隆

GenBank公布的人ETA（NM_001957.3）基因序列大小分别为1 284 bp。以上述提取的A549总RNA为模板，通过RT-PCR获得ETA基因PCR产物，并进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示克隆到了约1 300 bp大小的条带（图3），与目的条带大小基本一致。

2.3 pTag-Lite SNAP-ETA质粒构建及鉴定

利用ApaI和XhoI双酶切位点将ETA基因片段连接入pTag-Lite SNAP质粒上，转化入E.coliTOP10感受态细胞内，摇菌并接种于含氨苄霉素抗性筛选基因的平板上，过夜进行菌落PCR鉴定，并对菌落PCR阳性结果提取质粒进行双酶切验证（图4），将阳性克隆子送测序。经过数次测序结果显示pTag-Lite SNAP-ETA载体出现3处突变（图5-A），分别位于343（G-A），964（C-A）和1225（A-G）位，并影响其编码的氨基酸序列。利用定点突变原理依次对ETA进行定点突变，最后测序结果（图5-B）显示突变成功，pTag-Lite SNAP-ETA载体序列与目的序列一致。

2.4 荧光显微镜检测SNAP-ETA融合蛋白的表达

将CHO-K1细胞接种入黑色96孔板内，用FuGENE转染pTag-Lite SNAP-ETA表达载体，同时设置未转染对照组，转染24 h后用SNAP-tag底物孵育CHO-K1细胞，经SNAP-tag底物处理的细胞在荧光显微镜下观察并拍照。结果显示，没转化的细胞未见红色荧光（图6 -C），而转染pTag-Lite SNAPETRA（图6-D）的细胞可见红色荧光，证明SNAPETA融合蛋白在CHO-K1细胞内有效表达；与普通显微镜照片（图6-B）相比，SNAP-ETA融合蛋白表达量较大。

3 讨论

ETR广泛表达于人体的各组织器官，不仅存在于血管和支气管平滑肌，在心肌、肺脏、肾脏、肾上腺、脑、眼、肠等组织中也有不同亚型和不同密度的ETR分布。ETR与心血管疾病、肾脏疾病、糖尿病、自身免疫性疾病和癌症等众多疾病的发生发展有着密切的联系［12，16］。目前，阻断ETR（主要针对ETA）被认为是治疗高血压，尤其是肺动脉高压（Pulmonary artery hypertension，PAH）较有效的手段。内皮素受体拮抗剂分为肽类和非肽类两种类型：肽类ETR拮抗剂对ETA、ETB无选择性，半衰期短、生物利用度低，口服吸收不良，临床应用的疗效不理想。非肽类ETR拮抗剂半衰期较长，口服吸收良好，目前成为主要研发的方向。目前已经上市的内皮素受体拮抗剂有波生坦、西他生坦和安倍生坦，均为治疗肺动脉高压的药物［17］。马西替坦在肺动脉高压治疗中表现出良好临床疗效以及良好的耐受性［18，19］，其开发已进入注册阶段。然而波生坦因用药量大、药物相互作用多以及肝脏毒性等缺点，其应用受到限制［17］，西他生坦更是因其致死性肝脏损伤于2010年撤市。现有的药物对肺动脉高压以及其他相关疾病的治疗远远不够，还需要寻找更多安全有效的药物。解决此问题，建立快捷方便的筛选方法是加快寻找ETR拮抗剂比较有效的途径。

为建立ETA特异的拮抗剂筛选系统，本研究成功地从A549细胞RNA中克隆了人ETA基因，并采用了真核表达载体pTag-lite SNAP作为载体质粒，融合表达了SNAP-ETA蛋白。Tag-lite是SNAP-Tag与HTRF技术相结合用来进行细胞表面受体分析的一种技术［20］。SNAP是小的融合标签蛋白，可以非常容易地融合到目标蛋白的N端，又可特异性地与底物通过苄甲基不可逆共价结合，底物可与各种染料形成衍生物，这样就可以通过对底物进行荧光标记进而定位目标蛋白。另外，当底物与HTRF荧光染料反应形成衍生物，SNAP-ETA融合蛋白通过与底物特异结合被标记，这时加入受体荧光染料标记的配体，就可以根据试验目的进行受体配体结合、ETA异源二聚化试验、寡聚化试验以及内源化试验等细胞表面受体分析［20］。以此原理建立的ETA拮抗剂筛选模型信噪比强，灵敏度高，并可实现高通量筛选。

4 结论

本研究成功构建了pTag-Lite SNAP-ETA真核表达载体，并完成在CHO-K1细胞内瞬时表达，为ETA的体外研究及其拮抗剂筛选、活性评价等与之相关研究提供了新的方法。

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（责任编辑 李楠）

Clone and Expression of Human ETA

Pan Xiaofei1Shi Lili2Tan Chubing2Lü Chaojun1Xu Weiren2Tang Lida2
（1. Basic Medical College，Tianjin Medical University，Tianjin 300070；2. Tianjin Key Laboratory of Molecular Design and Drug Discovery，Tianjin Institute of Pharmaceutical Research，Tianjin 300193）

It was to facilitate inhibitor screening of endothelin receptor, cloning of human endothelin receptor geneETA, construction of eukaryotic expression vectors and transient expression of pTag-Lite SNAP-ETAin CHO-K1 cells. Method HumanETAgene fragment were amplified from human lung cancer cell line A549 via RT-PCR and inserted into pTag-Lite SNAP plasmid, the recombinant plasmids were then transiently transfected into CHO-K1 cells using FuGENE® HD, expression ofETAwas observed via fluorescence microscope. Result Sequencing result showed pTag-Lite SNAP-ETAexpression vector were correctly constructed. Fluorescence microscope images indicated that two vectors were expressed in CHO-K1 cells.

human endothelin receptor gene RT-PCR pTag-Lite SNAP CHO-K1 cell expression

2013-08-12

天津市应用基础及前沿技术研究计划（12JCYBJC18800），国家“重大新药创制”科技重大专项（2012ZX09105102，2011ZX-09401-009）

潘晓菲，女，硕士研究生，研究方向：药理学；E-mail：sumu7@126.com

时丽丽，女，助理研究员，博士，研究方向：药理学及新药发现，E-mail：shill@tjipr.com；汤立达，男，研究员，博士生导师，博士，研究方向：心血管药理学及药物创新设计，E-mail：tangld@tjipr.com