金枪鱼组胺检测技术研究进展

刘书臣，廖明涛，林森森，赵巧灵，戴志远，2，*（.浙江工商大学水产品加工研究所，浙江杭州30035；2.浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室，浙江杭州30035）

金枪鱼组胺检测技术研究进展

刘书臣1，廖明涛1，林森森1，赵巧灵1，戴志远1，2，*（1.浙江工商大学水产品加工研究所，浙江杭州310035；2.浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室，浙江杭州310035）

组胺是一种有潜在危害的含氮低分子量有机化合物，广泛存在于各种食品中，在以金枪鱼为代表的红肉鱼中容易大量产生。摄入过量的组胺会对人体产生危害，组胺已经成为判断金枪鱼质量的标准之一。对近年来金枪鱼肉中组胺的检测技术进行了综述，包括分光光度法、反相高效液相色谱法、离子色谱法、薄层色谱法、毛细管电泳法、电化学法和比色法等，并对检测技术的研究前景进行了展望。

金枪鱼；组胺；检测技术

金枪鱼类是硬骨鱼纲（Osteichthyes），鲈形目（Pereiformes），鲭科（Scombridae）鱼类中具有胸甲的鱼类的总称，广泛分布于太平洋、大西洋、印度洋的热带、亚热带和温带广阔水域[1]。常见的金枪鱼类有5个属，17个种。金枪鱼属的7种金枪鱼即长鳍金枪鱼、黄鳍金枪鱼、大目金枪鱼、北部蓝鳍金枪鱼、南部蓝鳍金枪鱼、大西洋金枪鱼、青甘金枪鱼，它们和鲣属的鲣鱼被称为主要金枪鱼类，这8种金枪鱼占全世界金枪鱼渔获量的70%以上[2]。金枪鱼肉质柔嫩鲜美，蛋白质含量高，氨基酸配比优越，富含DHA、EPA等具有生物活性的高度不饱和脂肪酸，是世界营养学会推荐的三大营养鱼之一，有“海底鸡”的美誉。

金枪鱼作为主要的红肉鱼种，其体内含有较多的游离组氨酸，当鱼捕捞后，若不能进行迅速、正确的处理，在产组胺菌的作用下，鱼肉中的组氨酸经过脱羧作用会产生大量的组胺[3-4]。食用已经腐败或者被微生物污染的金枪鱼会引起组胺中毒，组胺摄入量达8 mg～40 mg即可引起轻微中毒[5]。组胺中毒的特点是发痛快、症状轻、恢复快、潜伏期短，表现为精神萎顿、过敏、皮肤潮红、呕吐、腹泻等[6]。美国FDA要求进口的水产品中组胺不超过50 mg/kg；欧盟规定鲭科鱼类中组胺不得超过100 mg/kg；我国规定鲐鱼中组胺不得超过1 000 mg/kg，其它鱼类小于300 mg/kg。组胺已经成为检验金枪鱼安全与否的重要指标，因此金枪鱼肉中组胺含量的检测就显得尤为重要。本文综述了近些年国内外金枪鱼肉中组胺的检测技术研究现状，并对其研究前景进行了展望。

1 分光光度法

分光光度法是我国国标《水产品卫生标准的分析方法》（GB/T 5009.45-2003）规定的水产品中组胺测定方法。它的原理是利用三氯乙酸对鱼肉进行浸泡，再用正戊醇提取鱼肉中的组胺，组胺与偶氮试剂发生反应会显橙色，然后利用分光光度计于480 nm处测其吸光度，并与标准系列比较进行定量分析。

朱文慧等[7]在国标的基础上对分光光度法测定金枪鱼罐头中组胺的方法进行了改进，包括三氯乙酸浸提、正戊醇的提取方式、盐酸提取液浓度等。结果显示在60℃水浴、30 min条件下，三氯乙酸的提取效果最佳；正戊醇提取过程采用旋涡后离心的方式代替了分液漏斗振摇，获得了较佳的提取效果；盐酸提取液改为1.0 mL，实验结果的准确性高。该方法的测定结果相对标准偏差均小于5%，组胺平均回收率在81.54%以上。黄志勇[8]采用0.2%对氨基苯磺酸-0.4%HCl-10%NaNO2-2.0%Na2CO3显色体系，测得鱼肉中组胺浓度在2.8 μg/mL内吸收呈线性，测定的回收率在80%以上，变异系数小于4.5%。此方法直接与安全的氨基苯磺酸重氮化反应，避免了有致癌性的对硝基苯胺的使用，去掉了有毒的有机溶剂。

分光光度法测组胺具有不需要贵重仪器、操作简单、成本低等优点。但是此方法样品处理时间长，仅三氯乙酸浸泡就要3 h；偶氮试剂对硝基苯胺具有致癌性，长期接触对人体有害；结果重现率不高，不适宜用于组胺的快速检测。

2 色谱法

2.1 反相高效液相色谱

反相高效液相色谱（Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography，RP-HPLC）是目前应用最广泛的组胺检测技术之一。RP-HPLC的固定相采用的是十八烷基硅烷键合硅胶和辛烷基硅烷键合硅胶等非极性物质，典型的流动相是甲醇和乙腈。在RPHPLC中，组分根据其极性大小实现分离，极性大的先流出色谱柱，极性小的后流出[9-10]。利用RP-HPLC可以分离几乎所有的有机化合物，因此RP-HPLC被多数研究者选择用来进行金枪鱼肉中组胺的定量分析。由于组胺在可见和紫外可见区域没有较明显的吸收，也不含荧光成分，因此在检测前需要对组胺进行衍生处理，衍生剂主要是丹磺酰氯和苯甲酰氯邻苯二甲醛等。Saeed等[11]比较用苯甲酰氯邻苯二甲醛进行柱前衍生和柱后衍生对金枪鱼肉中组胺检测结果的影响，发现柱前衍生能显著增强检测的灵敏度，而且衍生产物稳定，检测结果更加准确。

检测器是RP-HPLC检测组胺的重要组成部分，可分为紫外检测器（UV）、荧光检测器（FLD）和二极管阵列检测器（DAD），其中UV检测器是目前应用最多的检测器。邢丽红等[12]利用UV检测器检测水产品中的组胺含量，组胺浓度在0.5 g/mL～20.0 g/mL范围内线性关系良好，相关系数r>0.999，检出限为25 mg/kg。Saeed等[11]同时用FLD和UV检测器检测金枪鱼肉中的组胺含量，发现FLD的检测效果远比UV检测的效果好，UV检测的结果有55%偏差较大，而FLD检测的结果重复性好，组胺在5.0 g/mL～100.0 g/mL范围内有较好的线性关系，最低检出限1.5 mg/kg[11]。二极管阵列检测器是一种新型的检测器，Cinquina A.L.[13]利用DAD对金枪鱼样品进行检测，组胺的检测结果线性关系良好，r>0.999，最低检出限为0.5 mg/kg，组胺平均回收率在92%以上。

反相高效液相色谱具有分析速度快、检测灵敏度高、定量分析准确、柱效高等优点，是目前金枪鱼肉中组胺检测的主要手段。但是由于组胺在紫外可见区域没有较明显的吸收，利用反相高效液相色谱检测前需要对组胺进行衍生处理，检测时间较长，成本较高。

2.2 离子色谱

离子色谱法（Ion Chromatograph，IC）是以离子交换剂为固定相的分析离子的一种液相色谱方法，主要利用离子之间对离子交换树脂亲和力的差异而实现物质分离。离子色谱又分为高效离子交换色谱（HPIC）、离子排斥色谱（IEC）和离子对色谱（IPC），用于3种分离方式的柱填料的树脂骨架基本都是苯乙烯-二乙烯基苯的共聚物，但树脂的离子交换功能基和容量各不相同。离子色谱的检测限为每升微克至每升毫克级，常用的检测器有电化学检测器和光学检测器，常常在流动相中加入一定量的有机溶剂，如乙醇、四氢呋喃、乙腈等，以增大组分在流动相中的溶解度[10]。

李立等[14]采用反相分配离子对色谱法对鱼肉中的组胺进行测定，通过对仪器条件的选择以及新的提取净化方法的建立，使组胺的检出限达到0.05 mg/kg，线性回归系数为0.999 7。Cinquina A.L.等[15]以中等强度和低疏水性的弱离子交换聚合色谱相为分离柱填料，采用电导检测器对金枪鱼肉中的组胺进行了检测，该方法简化了原料的处理过程，检测分析过程简单、快速，结果重现性好；同时通过比较发现，电导检测器法在样品处理和峰形上均优于脉冲安培检测法和全脉冲安培检测法。

离子色谱主要用于阴、阳离子的分析，可同时测定多种离子，具有简便、快速的优点。组胺是较弱的阳离子，适于采用离子色谱法进行测定。与其它组胺检测方法相比，离子色谱不需要衍生过程，缩短了分析时间，减少了衍生化带来的干扰和衍生物不稳定等问题，提高了分析方法的稳定性和重现性[9]；离子色谱的检测限为每升微克至每升毫克级，可以精确测量低浓度的组胺。但是离子色谱柱贵，易受污染，检测成本高，难以广泛推广。

2.3 薄层色谱

薄层色谱（Thin Layer Chromatography，TLC），又称薄层层析色谱，是一种固液吸附色谱。具体方法是将适宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或铝基片上，成一均匀薄层，待点样、展开后，与适宜的对照物按同法所得的色谱图作对比，用以进行药品的鉴别、杂质检查或含量测定。TLC是近年来发展起来的一种微量、快速而简单的色谱法，它兼具柱色谱和纸色谱的优点。TLC不仅可以用来进行少量样品的分离，同时也可以通过加厚吸附层来分离大量样品，特别适用于挥发性较小或在较高温度下易发生变化而不能用气相色谱分析的物质[10]。TLC已经被广泛的应用于鱼肉中组胺的检测。

Shakila R.J.等[16]比较了TLC法和HPLC法测定鱼肉中的生物胺，发现TLC法测定生物胺的结果线性关系和重现性均比HPLC差，但是能较好的实现不同生物胺的分离，可以准确的对组胺进行定量分析，而且测定时间短、价格低廉，适用于组胺的快速测定。Chin K.D.H等[17]利用层析色谱法同时对组胺、酪胺、色胺和苯乙胺进行分离检测，以丹磺酰氯为衍生剂，四种生物胺检测结果均具有良好的重现性和线性关系。Lapa-Guimaraes和Pickova[18]用一种半定量薄层色谱，同时分离检测了鱼肉中包括组胺在内的多种生物胺，其中组胺的检测结果在1.0 μg/mL～50 μg/mL内呈线性，最低检出限为10 ng。

与其它的组胺分离检测方法相比，TLC不需要昂贵的仪器、操作简单快捷，能有效降低检测成本，可用于组胺的定性和半定量分析。但是需要花费大量时间进行结果的处理与分析，样品检测前也需要进行衍生处理。

3 毛细管电泳

毛细管电泳（Capillary Electrophoretic，CE），是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的新型液相分离技术。目前在毛细管电泳分离生物胺的技术中，仅有毛细管区带电泳技术可直接对生物胺进行分析测定而不需要衍生化过程。

张丽瑶等[19]提出了毛细管电泳-2，3-萘二甲醛（NDA）柱前衍生高灵敏安培检测组胺的新方法，通过对衍生反应条件和电泳分析条件，包括衍生试剂浓度、衍生溶液的pH、衍生反应时间、分离介质的pH、进样时间和分离电压进行了优化，使组胺测定灵敏度提高了6倍，为测定痕量组胺提供了一个新方法。Lange J.等[20]比较了CE法和HPLC法对鲑鱼、鲱鱼、鳕鱼等多种食品中生物胺的测定结果，研究发现毛细管区带电泳可以大大缩短样品前处理和分离时间，CE法9 min内可以实现各种生物胺的分离，而HPLC需要20 min。Kvasnicka和Voldrich[21]提出了一种高效快捷的CE法，不需要对样品进行衍生，只需要稀释、酸性萃取和过滤等步骤，能够实现对奶酪、啤酒、牛奶等食品中生物胺的检测。该方法在10 min内分离了包括组胺在内的六种生物胺，其中组胺检测结果在5μmol/L～100μmol/L内呈线性，r=0.999 8，可以应用于鱼肉中组胺的检测。

带有紫外检测器的毛细管电泳法目前是比较流行的组胺检测方法。它与传统的电泳技术和现代色谱技术相比，具有较高的灵敏性和重现性、分离速度快、仪器简单、无污染等优点，但是和HPLC一样，由于组胺在紫外检测区域没有较强的吸收峰，因此不能直接进行检测，也需要先对样品进行衍生处理。

4 电化学法

电化学法（Electrochemical method）是近几年来发展起来的一种新的检测组胺的方法，此方法的应用需要同时建立能快速检测被分析物在电化学作用下所引起变化的检测系统。

Behrouz等[22]建立了一种高效流动电化学法对金枪鱼样品进行组胺检测的方法，条件为pH 2.0，电位扫描频率40 V/s，蓄积电势900 mV，蓄积时间0.4 s，同时还建立了一种精确分析被检测物信号变化和减少杂音影响的基于数字化方法的电脑检测系统。检测结果在1.1 pg/mL～5 555 pg/mL范围内线性良好，r=0.998，最低检出限为0.35 pg/mL。Draiscir等[23]研制了一种测定组胺的电化学生物传感器，通过检测样品在电化学作用下产生的过氧化氢量来对组胺进行检测。传感器主要是由一个铂电极和一个固定的银/氯化银电极构成，其中二胺氧化酶经固定后与铂电极的端部紧密接触。采用该方法对鱼肉中的组胺进行检测，检测结果良好，证实了电化学生物传感器能够有效测定鱼肉中产生的组胺。

与其它方法相比，电化学法具有精确、省时等优点，同时能够克服鱼肉中成分复杂和组胺含量低等困难，能够实现组胺的低浓度准确检测。但是电化学法测组胺还需要同时建立相应的检测系统，生物传感器所采用的生命活性物质容易受到环境中各种有害气体和微生物的污染，寿命过短。因此，采用电化学法测定金枪鱼肉中的组胺还有待于更深一步的研究。

5 比色法

S.B.Patange等[24]建立了一种比色定量法对组胺进行快速检测，该方法是以咪唑环与β-苯基重氮磺酸盐的相互作用为基础的比色定量法。不同浓度的组胺会与显色剂反应显现出不同的颜色，显色过程是在试管中进行的，主要步骤包括均质、离心、震荡和蒸发等。首先将不同浓度的组胺标准品进行显色处理，以确定不同浓度组胺所对应的颜色，然后对样品进行显色处理与标准品进行比较，同时检测样品和标准品在496nm处的紫外吸收强度，观察其结果是否具有相关性。结果显示线性关系良好r>0.995，组胺平均回收率为91%，最低检出浓度为10 mg/kg。S.B.Patange还将此方法与HPLC法测组胺进行比较，两者检测结果非常接近，HPLC的检测结果略高。

比色定量法法整个检测过程只需45 min，检测成本低，通过视觉上的差别判断来进行组胺的定量分析，适宜于管理机构在没有实验室条件的情况下对鱼肉中的组胺进行实时监控。但是该方法的最低检出浓度较高、结果重现率不高、精确度低，受人为因素影响较大。

6 展望

金枪鱼及其制品中组胺的检测备受关注除了因为其潜在的毒性，同时也是由于组胺可以作为一个重要指标来判断金枪鱼的腐败程度。组胺的检测有两个比较大的困难，首先是鱼肉中生物胺种类多，成分复杂，需要将组胺与其它生物胺进行分离；第二是组胺浓度较低时难以准确检测[25]。目前测定金枪鱼组胺的技术方法有分光光度法、反相高效液相色谱法、离子色谱法、薄层色谱法、毛细管电泳法、电化学法和比色法等，其灵敏度、精密度、特异性各异，实用性也不同。

近年来，酶联免疫吸附测定（ELISA）也被用来进行组胺的检测[26]，但是尚未应用于金枪鱼肉中组胺的检测。目前美国和澳大利亚市场上在售的ELISA试剂盒有ALERT试剂盒和VERATOX试剂盒，其中ALERT的组胺有效检测范围为5 mg/L～50 mg/L，检测时间为2 h，VERATOX的检测范围为0～50 mg/L，检测时间为1 h。这些ELISA试剂盒检测结果均具有较好的重复性和准确性，但是由于价格不菲而难以应用于日常大量样品的定性与定量分析，广泛推广受阻。因此需要开发一种灵敏度高、耗时短、成本低、实用性强的检测方法；同时，前处理方法的优化和不同检测方法的联合应用也将是今后金枪鱼组胺检测的重点研究方向。随着科学技术的发展和检测设备的不断改进，相信一定能够研发出更加适用于金枪鱼肉中组胺检测的方法，实现金枪鱼肉中组胺的快速定性与定量分析，进而帮助管理机构和生产厂商加强对金枪鱼质量的监管与控制。

[1]苗振清,黄锡昌.远洋金枪鱼渔业[M].上海:科学技术文献出版社, 2003

[2] 陈学锋.来自大洋深处的海鲜极品—金枪鱼[J].海洋世界,2004 (1):5-8

[3]Shalaby A R.Significance of biogenic amines to food safty and human health[J].Food Research International,1996,29:675-690

[4]Chang S C,Kung H F,Chen H C,et al.Determination of histamine and bacterial isolation in swordfish fillets(Xiphias gladius)implicated in a food borne poisoning[J].Food control,2008,19:16-21

[5]Parente E,Matuscelli M,Gardini F,et al.Evolution of microbial populations and biogenic amine production in dry sausages produced in Southern Italy[J].Journal of Applied Microbiology,2001,90: 882-891

[6]Hellstrand K.Histamine in cancer immunotherapy:a preclinical background[J].Semin Oncol,2002,29:35-40

[7]朱文慧,周德庆.分光光度法测定鱼罐头中组胺的方法改进[J].食品科技,2008(1):223-226

[8] 黄志勇.水产食品中组胺的测定[J].厦门水产学院学报,1992(14): 13-16

[9] 王艳,张建友,刘书来,等.水产品生物胺检测技术的研究进展[J].中国酿造,2009(6):17-19

[10]张微,李秀缺,陆容,等.浅谈食品中生物胺的检测方法[J].食品工程,2004(4):55-57

[11]Saeed Tahmouzi,Ramin Khaksar,Mehran Ghasemlou.Development and validation of an HPLC-FLD method for rapid determination of histamine in skipjack tuna fish(Katsuwonus pelamis)[J].Food Chemistry,2011,126:756-761

[12]邢丽红,冷凯良,孙伟红,等.高效液相色谱-紫外检测法测定水产品中组胺的含量[J].安徽农业科学,2011(3):7832-7834,7863

[13]Cinquina A L,Longo F,Calì A,et al.Validation and comparison of analytical methods for the determination of histamine in tuna fish samples[J].Journal of Chromatography A,2004,1032:79-85

[14]李立,李金强,钟响.反相分配离子对色谱法快速测定鱼肉中的组胺[J].检验检疫科学,2011(11):44-45

[15]Cinquina A L,Calì A,Long F,et al.Determination of biogenic amines in fish tissues by ion-exchange chromatography with conductivity detection[J].Journal of Chromatography A,2004,1032(1):73-77

[16]Shakila R J,Vasundhara T S,Kumudavally K V,et al.A comparison of the TLC densitometry and HPLC method for the determination of biogenic amines in fish and fishery products[J].Food Chemistry, 2001,75:255-259

[17]Chin K D H,Koehler P E.Identification and estimation of histamine, tryptamine,phenylethylamine and tyramine in soy sauce by thinlayer chromatography of dansyl derivatives[J].Journal of Food Science,1983,48:1826-1828

[18]Lapa-Guimaraes J,Pickova J.New solvent systems for thin layer chromatographic determination of nine biogenic amines in fish and squid[J].Journal of Chromatography A,2004,1045:223-232

[19]张丽瑶,黄卫华,王宗礼,等.NDA柱前衍生毛细管电泳高灵敏安培检测组胺[J].分析科学学报,2004(20):1-4

[20]Lange J,Thomas K,WIittmann C.Comparison of acapillary electrophoresis method with high performance liquid chromatography for the determination of biogenic amines in various food samples[J]. Journal of Chromatography B,2002,779:229-239

[21]Kvasnicka F,Voldrich M.Determination of biogenic amines by capillary zone electrophoresis with conductometric detection[J].Journal of Chromatography A,2006,1103:145-149

[22]Behrouz A,Parviz N,Mohammad R G,et al.Ultrasensitive flow-injection electrochemical method for determination of histamine in tuna fish samples[J].Food Research International,2010,43:1116-1122

[23]Draiscir R,Volpec G,Lucentinil L,et al.Determination of biogenic amines with an electrochemical biosensor and its application to salted anchovies[J].Food Chemistry,1998,62:225-232

[24]Patange S B,Mukundan M K,Ashok Kumar K.A simple and rapid method for colorimetric determination of histamine in fish flesh[J]. Food Control,2005,16:465-472

[25]Armagan Onal.A review:Current analytical methods for the determination of biogenic amines in foods[J].Food Chemistry 2007,103: 1475-1486

[26]Martin R E,Collette R L,Slavin J W,et al.Fish Inspection,Quality Control,and HACCP:A Global Focus[M].Lancaster:Technomic Publishing Co.,1997

Review on Detecting Techniques of Histamine of Tuna

LIU Shu-chen1，LIAO Ming-tao1，LIN Sen-sen1，ZHAO Qiao-ling1，DAI Zhi-yuan1，2，*
（1.Research Institute of Aqutic Products Processing，Zhejiang Gongshang University，Hangzhou 310035，Zhejiang，China；2 State Key Laboratory of Aquatic Products Processing of Zhejiang Province，Hangzhou 310035，Zhejiang，China）

Histamine is an nitrogenous organic compound with low molecular weight.Generally，it has potential hazard to human health，and always existed in food，especially in some red meat fish like tuna.Ingesting excessive histamine could cause toxicity to human，and histamine has been one of the standards to judge the meat quality of tuna.The detecting techniques of histamine of tuna were reviewed in this paper，including spectrophotometry，reversed phase high performance liquid chromatography，ion chromatograph，thin layer chromatography，capillary electrophoretic，electrochemical method and colorimetric method，and the prospect of the future developmentwas made.

tuna；histamine；detecting techniques

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.19.033

2013-07-26

国家海洋863计划（2012AA0922302）；国家科技支撑计划（2012BAD28B05）；浙江省科技厅重大项目（2012C03009-3）；浙江省科技厅重点项目（2012C12008-3）

刘书臣（1987—），男（汉），硕士研究生，研究方向：水产品加工与贮藏。

*通信作者：戴志远，研究员，博士生导师。