我国近海贝类体内帕金虫的亲缘关系

周广麒， 刘 雁， 李冬梅， 李秋菊， 刘 沙， 梁玉波

（1.大连工业大学 生物工程学院，辽宁 大连 116034；2.国家海洋环境监测中心，辽宁 大连 116023）

0 引 言

美国对贝类帕金虫（Perkinsus）的研究始于20世纪40年代，至今世界各国已普遍认为帕金虫与众多海产经济贝类的大规模死亡有关［1－2］。国际上已经公认的帕金虫有7种：包括P.marinus、P.olseni（P.atlantic）、P.qugwadi、P.andrewsi、P.mediterraneus、P.honshuensis 和 P.beihaisens等［3］。这些寄生虫分别在美洲、澳大利亚、新西兰、葡萄牙、西班牙、法国、意大利、韩国、日本、巴西、中国等国家的近海被发现［4－6］。

20世纪80年代初以来，我国先后引进了海湾扇贝、墨西哥湾扇贝、虾夷扇贝、长牡蛎、红鲍、绿鲍、象拔蚌、硬壳蛤、欧洲大扇贝等经济贝类进行养殖。由于多途径引种，国外贝类帕金虫已经不可避免地进入了我国海洋生态系统。梁玉波等检测到国内在栉孔扇贝、海湾扇贝、虾夷扇贝、菲律宾蛤仔、魁蚶、四角蛤蜊体内均有大量的帕金虫［7］，并确定其为P.olseni（P.atlantic）的新地理亚种［8］，使我国的帕金虫研究具有国际性。

在真核生物基因组编码核糖体的基因中，18S、5.8S和28SrDNA基因的间隔区为内转录间隔区，由于进化相对迅速而具多态性，真核生物rDNAITS序列在进化上具有保守性，对此序列的检测有助于分析其遗传关系。帕金虫的rDNA－ITS序列可以准确地区分帕金虫除P.qugwadi以外的所有种类或发现未知种［9－10］，序列差异在4%～14%的为不同种帕金虫，序列差异在0～3%的为不同地理亚种。本文利用聚合酶链式反应法，对我国沿海从北到南58个采样点共30种主要的经济贝类样品进行rDNA－ITS序列扩增，以分析确定我国贝类体内帕金虫的种类及地域分布。

1 材料与方法

1.1 样品的采集与固定

对我国从南至北海岸线58个站位点30种经济贝类进行采集，共得到163个样品，采集点地理位置和样品名称见表1。将采集的样品置于95%乙醇溶液中进行固定［7］。

1.2 基因组DNA的提取

每个样品随机挑取5个贝体，用无菌剪刀取其鳃和消化腺，剪碎、混匀。分别取混匀后的鳃及消化腺各20mg提取基因组DNA。提取方法按DNeasy组织试剂盒（Qiagen）操作手册指南进行。

1.3 rDNA－ITS的PCR扩增与电泳

采用 OIE 公 布 引 物 PerkITS85：5′－CCGCTT－TGT－TTG－GAT－CCC－3′／PerkITS750：5′－ACA－TCA－GGC－CTT－CTA－ATG－ATG－3′，该 引物可以扩增所有除P.qugwadi以外的帕金虫rDNA－ITS序列。

反应体系：PCR反应液体系（Takara Ex Taq，日 本）；引 物 PerkITS85／PerkITS750 各10pmol；样品基因组DNA溶液50ng以上。

扩增：使用PCR扩增仪（ABI9700，美国），95℃解链4min；40个循环，每个循环包括95℃解链1min—53℃退火1min—65℃延伸3min；最后65℃继续延伸5min。PCR扩增反应同时做阴性和阳性对照样反应，阴性反应无扩增，阳性对照样扩增片段及目的片段大小为660bp左右。

电泳：取8μL PCR产物于3%琼脂糖凝胶进行电泳。琼脂糖凝胶用GeneFinder染色，电泳缓冲系统：0.5×TBE［89mmol／L Tris，89mmol／L硼酸，2mmol／L EDTA（pH 8.0）］，于凝胶成像系统（KodakGel2200，美国）照相。

1.4 rDNA－ITS测序及分析

将PCR产物测序（ABI PRISMTM377XL，美国）。BLAST后，与参考序列进行比对。采用MAGA4软件建立系统发生树，分析亲缘关系。

rDNA－ITS 参 考 序 列 如 下：P.qugwadi AF151528；P.marinus U07700；P.chesapeaki（P.andrewsi）AY876311；P.olseni （P.atlanticus）U07701；P.honshuensis DQ516696；P.olseni DQ516703；P.beihaiensis EF204067；P.mediterraneus EU068099；P.beihaiensis JN054741等。

2 结果与讨论

2.1 rDNA－ITS的PCR扩增结果

琼脂糖凝胶进行电泳结果见图1所示（由于样品数量多，在此并未给出所有电泳结果）。由图1可见，12个站位的5种经济贝类共14个样品的rDNA－ITS的PCR扩增片段大小近700bp，阴性反应无扩增，阳性对照反应扩增片段大小近700bp。扩增出片段的样品包括：福建漳州的菲律宾蛤仔，广西北海的菲律宾蛤仔、近江牡蛎，海南三亚的近江牡蛎，海南海口的菲律宾蛤仔，广东湛江的近江牡蛎，广东阳江的近江牡蛎、毛蚶，福建泉州的菲律宾蛤仔，浙江台州的菲律宾蛤仔，辽宁金石滩的菲律宾蛤仔，山东莱州的菲律宾蛤仔，河北昌黎的紫贻贝，辽宁龙王塘的皱纹盘鲍。

图1 样品的凝胶电泳图Fig.1 Agarose gel electrophoresis of the samples

2.2 rDNA－ITS的序列分析及亲缘关系分析

经BLAST比对共得2种rDNA－ITS序列：

福建漳州的菲律宾蛤仔、广西北海的菲律宾蛤仔、海南海口的菲律宾蛤仔、广东阳江的毛蚶、福建泉州的菲律宾蛤仔、浙江台州的菲律宾蛤仔、辽宁金石滩的菲律宾蛤仔、山东莱州的菲律宾蛤仔、河北昌黎的紫贻贝和辽宁龙王塘的皱纹盘鲍的rDNA－ITS序列一致，命名为序列rDNA－ITS－1，其与P.olseni（P.atlantic）在NCBI已报道序列DQ516703的同源性为99%。图2为海南海口杂色蛤仔序列对比图。

表1 贝类采样点位置和样品Tab.1 The locations of shellfish sampling points and the samples

广西北海、海南三亚、广东湛江和广东阳江的近江牡蛎rDNA－ITS序列一致，命名为序列rDNA－ITS－2，与 NCBI数据库中 P.beihaiensis已报道序列EF204067的同源性为100%。

比对海南海口杂色蛤和广西北海近江牡蛎的rDNA－ITS－1与rDNA－ITS－2（图3），同源性为85%。

图2 海南海口菲律宾蛤仔寄生帕金虫与DQ516703序列对比图Fig.2 Comparision of ITS sequence of perkinsus in R.philippinarumof Haikou Hainan and DQ516703

图3 海南海口菲律宾蛤仔与广西北海近江牡蛎寄生帕金虫的ITS序列对比图Fig.3 Comparision of ITS sequence of perkinsus in Ostrea rivularis Gouldof Beihai Guangxi and R.philippinarumof Haikou Hainan

将所得两种rDNA－ITS序列与参考序列进行基因比对，做成系统发生树，见图4。

图4 帕金虫的系统发生树Fig.4 Phylogenetic tree of Perkinsus

国际公布的7种帕金虫中，P.olseni、P.honshuensis、P.mediterraneus、P.marinus的亲缘关系较为接近，P.chesapeaki和P.beihaiensis次之，而P.qugwadi与其他6种帕金虫的亲缘关系最远［11］。本试验检测出的rDNA－ITS－1与rDNA－ITS－2分别与P.olseni和P.beihaiensis亲缘关系最近。

rDNA－ITS－1 与 rDNA－ITS－2 的 差 异 为15%，可认为rDNA－ITS－1与rDNA－ITS－2来自于两种不同的帕金虫；rDNA－ITS－1之间及与P.olseni参考序列的差异为1%，可能为P.olseni的不同的地理亚种。

3 结 论

我国辽宁、河北、山东、浙江、福建、广东、广西、海南等8省沿海存在着P.olseni和P.beihaiensis两种帕金虫。P.olseni从北至南广泛分布，寄生于多地区的菲律宾蛤仔以及个别地区的毛蚶、紫贻贝、皱纹盘鲍等经济贝类体内。P.beihaiensis仅在广东、广西、海南等南方海域的近江牡蛎中检出。

我国沿海有13个省、市、自治区，本试验覆盖了其中9个省，其中除江苏省以外的8个省均呈帕金虫rDNA－ITS PCR的阳性扩增。随着贝类国际贸易的不断增加和频繁引种，帕金虫经由多种途径传播到我国沿海各地，适应我国沿海环境后产生新的地理亚种，同时我国的帕金虫也会经由多种途径传播到其他国家。帕金虫的危害极大，应加强对帕金虫病害的监测和防范，做好预防病害大规模发生的准备工作。

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