血小板膜糖蛋白Ibα基因多态性与复发性脑梗死的分析研究

徐福平,李湘青

(淄博市中心医院神经内科,山东 淄博 255036)

复发性脑梗死是遗传因素、环境因素与伴发病相互作用的结果。常见环境因素为吸烟、酗酒；常见伴发病为原发性高血压、糖尿病、高脂血症，特别是代谢综合征[1]。Liu等[2]根据我国卒中流行病学调查报告认为，心房颤动、短暂性脑缺血发作、特别是原发性高血压合并糖尿病与脑梗死的复发有关。对于遗传易患性研究不多，有研究发现血小板膜糖蛋白(platelet glycoprotein,GP)受体基因多态性与脑梗死发病有关[3]。本研究主要分析复发性脑梗死与初发脑梗死患者发病时血液中血小板膜糖蛋白Ibα链(platelet glycoprotein，GPIbα)可变数目串联重复序列(variable number of tandem repeats,VNTR)的多态性的表现，以期了解GPIbαVNTR在脑梗死复发过程中所起的致病作用。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2010年2月至2011年1月淄博市中心医院神经内科收治的复发性脑梗死患者作为复发组，初次脑梗死患者为初发组。复发组110例，男57例、女53例，年龄45～80(62±12)岁；初发组105例，男52例、女53例，年龄47～79(60±12)岁。两组患者的年龄、性别等一般资料比较具有均衡性。

1.2纳入排除标准 脑梗死的诊断标准参照中华医学会第四届全国脑血管病学术会议制订的诊断标准[4],全部经头颅CT/磁共振成像证实确诊有新发的脑梗死病灶。复发的诊断标准[4]：患者原有初发症状和体征加重，距第一次梗死时间>1个月,本次发病有经过影像学证实的新病灶。排除标准：排除青年卒中、炎性血管病变、烟雾病、有心房颤动史、头颈部磁共振血管成像有明显的大动脉狭窄(颈内动脉、大脑中动脉起始段狭窄>50%)者。

1.3研究方法

1.3.1病史、标本采集 详细询问受试者心脏病、原发性高血压、高脂血症、糖尿病、脑血管病及吸烟史(每日10支，至少5年)。

记录血压、血糖、血脂及磁共振成像结果。所有受检者禁食12 h后于清晨7:00抽取静脉血1 mL置于放有20 μL乙二胺四乙酸抗凝剂管中备用。

1.3.2基因分析 ①提取基因组DNA：应用北京赛百盛试剂盒，严格按血液DNA抽提试剂盒说明提取DNA。②DNA纯度测定：应用紫外分光光度计测定DNA纯度。③聚合酶链反应(polymerase chain reaaion，PCR)。

扩增：上游引物为5-CAC TAC TGA ACC AAC CCC AAG-3；下游引物为5-TTG TGG CAG ACA CCA GGA TGG-3。④扩增循环参数：预变性95 ℃ 4 min；95 ℃变性45 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，扩增38个循环；最后72 ℃延伸8 min。⑤PCR产物的检测:吸取PCR产物10 μL在封口膜上和上样缓冲液2 μL充分混匀后，依次加入2%琼脂糖凝胶的加样孔中；吸取DNA标志物12 μL加入一侧的加样孔中，在硼酸缓冲液中电泳40 min，放入紫外分析装置中观察结果。

1.4统计学方法 应用SPSS 10.0软件进行数据统计处理，计数资料采用χ2检验，多因素分析采用Logistic回归分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1两组患者的临床基本特点 复发组原发性高血压、糖尿病、高脂血症的比例较初发组高，差异均有统计学意义(P<0.05)(表1)。

表1 两组脑梗死患者的临床基本特点 [例(%)]

2.2GPIbα VNTR基因多态性频率分布 GPIbα的VNTR多态性中，各等位基因间依次相差39 bp,在本研究中经PCR扩增后分别产生273 bp、234 bp、195 bp的扩增产物，PCR扩增产物为195 bp含有1个重复序列，产物为234 bp含有两个重复序列,产物为273 bp含有3个重复序列(图1)。未发现A、B等位基因纯合子及AB、AC基因型，以CC、CD基因型和C、D等位基因多见。基因型表现为BC 25例(11.63%)、BD 7例(3.27%)、CC 87例(40.46%)、CD 73例(33.95%)、DD 23例(10.70%)，等位基因为B 32例(7.44%)、C 272例(63.26%)、D 126例(29.30%)。

M:Marker；1:DD基因型；2、3:DC基因型；4：CC基因型；5：BC基因型；6：BD基因型

2.3两组患者基因型分布的比较 复发组BC基因型的比例高于初发组(P<0.05)，两组间BD、CC、CD、DD基因型比较差异无统计学意义(P>0.05)(表2)。

表2 两组各基因型的分布 [例(%)]

2.4两组等位基因频率的比较 复发组B等位基因频率高于初发组(P<0.05)，两组间C、D基因频率比较差异无统计学意义(P>0.05)(表3)。

表3 两组等位基因频率的比较 [例(%)]

2.5Logistic回归分析 以脑梗死复发为因变量，以原发性高血压、高脂血症、糖尿病、B等位基因、BC基因型为自变量，进行Logistic回归分析，结果显示：B等位基因、BC基因型、原发性高血压、糖尿病是脑梗死复发的独立危险因素(表4)。

表4 Logistic回归分析结果

3 讨 论

脑梗死具有高复发性的特点，由于复发率高又使其致残率、致死率进一步升高，预防脑梗死复发已经引起高度关注。近十几年来，应用PCR技术研究血小板膜GPIbα[5]基因多态性日益成熟。GPIbα是血小板膜表面最突出的唾液酸糖蛋白，N端位于膜外区，向血流突出，含有假性血管性血友病因子(Von Willebrand factor,vWF)和凝血酶的结合位点，vWF结合位点突出于血小板表面，此结构与其功能密切相关，合适的长度才能保证vWF与GPIb之间适度的亲和力，维持正常的生理功能[6]。GPIbα有三种基因多态性，尚迎辉等[7]研究结果显示，GPIbα人类血小板同种异体抗原2(Human platelet antigen-2，HPA-2)基因多态性与河南地区动脉硬化性脑梗死无关。李现亮[8]研究显示，GpIbα Kozak序列和HPA-2的基因多态性与脑梗死无相关性,VNTR基因多态性与脑梗死相关，认为其DD基因型是脑梗死独立危险因素，当D等位基因存在时，人体易于形成血栓。张爱琴等[9]认为GpIbα Kozak存在基因多态性，并通过影响血小板的活化参与脑梗死的发生，而GpIbαHPA-2未发现多态性。本研究结果显示，基因型以CC(37.67%)、DD(33.95%)表达较高，基因以C(73.02%)表达较高，未发现A等位基因表达，BC、BD基因型和B等位基因在本研究中表达不高。复发性脑梗死组有17例表达BC基因型，初发组有4例(P<0.05)；而BD、CC、CD、DD基因型两组间差异无统计学意义，说明BC基因型是脑梗死复发的致病基因型。这一研究结果与尚迎辉等[10]的结果一致，认为BC基因型是动脉硬化性脑梗死发病的危险因素。本研究还发现，复发组B等位基因频率显著高于初发组(P<0.05)，说明B等位基因是脑梗死复发的致病因素。Logistic回归分析结果显示，高血压、糖尿病、B等位基因、BC等位基因是脑梗死复发的危险因素。

VNTR多态性与复发性脑梗死相关，其病理机制可能是BC基因型、B等位基因不同，使GPIbα与vWF结合位点延伸有关，因这种结构的改变影响了GPIbα与vWF的亲和力，导致血小板的黏附、聚集和活化反应，特别是在高血流高切应力作用时(如动脉狭窄或痉挛的动脉)，GPIbα复合物与vWF因子结合使血小板活化聚集形成血栓，血栓的形成使管腔进一步狭窄，高切应力进一步增加，形成恶性循环，从而不需要其他的激动剂就能再次激活血小板，临床可表现为进展性脑卒中，复发性脑卒中[11]。Baker等[12]对阿司匹林治疗失败，脑梗死复发患者的基因因素进行分析，结果显示，BC基因型是阿司匹林治疗失败复发性脑梗死的独立因素。

近年来我国各地区对血小板膜GPIbαVNTR基因多态性的研究结果均确定其与脑梗死相关，但基因型和等位基因结果差异较大，有望通过对GPIbα基因多态性的研究，针对GPIbα及vWF的抗血小板药物的研制，为预防脑梗死复发提供理论依据。

[1] 黄成锋,卢常盛,黄汉宁，等.青年、中年及老年大动脉粥样硬化脑梗死危险因素比较分析[J].中国医药指南，2010,8(15)：170-172.

[2] Liu M,Wu B,Wang WZ,etal.Stroke in China:epidemiology,prevention,and management strategies[J].Lancet Neurol,2007,6(5):456-464.

[3] Debette S，Seshadri S.Genetics of atherothrombotic and lacunar stroke[J].Circ Cardiovasc Genet,2009,2(2)：19l-198.

[4] 全国第四届脑血管病学术会议.各类脑血管病诊断要点[J].中华神经科杂志，1996,29(6)：376-381.

[5] Serebruany VL,Malinin AL，Oshrine BR，etal.Lack of uniform platelet activation in patients after ischemic stroke and choice of antiplatelet therapy[J].Thromb Rese,2004,113(3/4)：197-204.

[6] Corral J,Gonzalez-Coneiero R,Lazano ML,etal.New alleles of the platelet glycoprotein Ib alpha gene[J].Br J Haematol,1998,103(12):997-1003.

[7] 尚迎辉，李涛，白峻瑜,等.河南汉族动脉硬化性脑梗死人群血小板膜糖蛋白HPA-2基因多态性检测[J].郑州大学医学科学杂志，2012,47(5):605-607.

[8] 李现亮.血小板膜糖蛋白Ibα基因多态性与脑梗死相关性研究[J].济南：山东大学,2006.

[9] 张爱琴，郑敏，郝跃伟,等.脑梗塞患者血小板膜糖蛋白Ibα基因HPA-2、Kozak位点多态性分析[J].山东医药,2010，50(38)：23-24.

[10] 尚迎辉，白峻瑜，石聪聪,等.血小板膜糖蛋白Ibα基因多态性与动脉硬化性脑梗塞中医证型的相关性[J].时珍国医国药,2012,23(8):1994-1996.

[11] Matsubara Y,Mumta M，Havashi T,etal.Platelet glycoprotein Ib alpha polymorphisms affect the interaction wth von Willebrand factor under flow conditions[J]Br J Haematol,2005,128(4)：533-539.

[12] Baker RI,Eikelboom J,Lofthouse E,etal.Platelet glycoprotein Ibalpha kozak polymorphism is associated with an increased risk of ischemic stroke[J].Blood，2001，98(1):36-40.