余甘子中没食子酸等活性成分在自然储藏时的变化及分析

2014-03-27赵江盛徐志平张建博

云南中医中药杂志 2014年2期

范源，赵江盛，徐志平，张建博，林青

(1.云南中医学院，云南昆明 650500； 2.龙润集团爱尼食品厂，云南昆明 650100)

余甘子(Phyllanthus emblica)是大戟科(Euphorbiaceae)叶下珠属(Phyllanthus)的一种生长在中国亚热带、热带部分地区，特别是干热河谷地区的落叶乔木或灌木资源植物[1]。余甘子因其具有抗氧化、抗衰老、防癌症、抗心血管病、治糖尿病等多种保健与治疗的作用而广泛应用[2-5]。余甘子果实在贮运中易发生褐变对其保存与加工及产品的稳定性均有较大的影响。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料余甘子果实：本文采用对云南澜沧江、金沙江、元江流域的7个县同时采集获得的余甘子作为实验材料。

1.2 试验方法

1.2.1 没食子酸含量测定方法

1.2.1.1 仪器与试剂 Agilent1100(VWD检测器)、甲醇(色谱纯)、磷酸、纯化水、没食子酸对照品(购自云南省药检所)含量98%。

1.2.1.2 测定方法以十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂；以甲醇-0.2%磷酸溶液(5：95)为流动相；检测波长为273 nm。理论板数按没食子酸峰计算应不低于2000。对照品制备：取没食子酸对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1 mL含25 μg的溶液。供试品制备：取约200 g橄榄果实榨汁后，称取原果汁约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液。分别精密吸取对照品溶液10 μL与供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪，测定，外标法计算。

1.2.2 超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定

1.2.2.1 仪器与试剂紫外-可见分光光度计：岛津UV2450、精密酸度计(0.01 pH)、离心机、10 mL比色管、10 mL离心管、玻璃乳钵、A液：pH 8.20的0.1 mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(内含1 mmol/L EDTA 2Na)、B液：4.5 mmol/L邻苯三酚盐酸溶液、10 mmol/L盐酸溶液、蒸馏水。

1.2.2.2 测定方法 (1)在25℃左右，于10 mL比色管中依次加入A液2.35 mL，蒸馏水2.00 mL，B液0.15 mL，加入B液立即混合并倾入比色皿，分别测定在325 nm波长条件下初始时和1 min后吸光值，二者之差即邻苯三酚自氧化速率ΔA325(min-1)。本试验确定ΔA325(min-1)为0.060。(2)样液和SOD酶液抑制邻苯三酚自氧化速率测定按步骤1分别加入一定量样液或酶液使抑制邻苯三酚自氧化速率约为1/2ΔA325(min-1)，即ΔA325(min-1)为0.030。

(公式1)

1.2.3 抗坏血酸(维生素C)含量的测定

1.2.3.1 仪器与试剂恒温箱：(37±0.5)℃、可见-紫外分光光度仪：岛津(UV2450)、捣碎机、4.5mol/L硫酸、85%硫酸、2，4-二硝基苯肼溶液(20 g/L)、草酸溶液(20 g/L)、草酸溶液(10 g/L)、硫脲溶液(10 g/L)、硫脲溶液(20 g/L)、1 mol/L盐酸、抗坏血酸标准溶液：称取100 mg纯抗坏血酸溶解于100 mL浓度为10 g/L草酸溶液中，此溶液每毫升相当于1mg抗坏血酸、活性炭：将100 g活性炭加到750 mL浓度为1 mol/L的盐酸中，回流1～2 h，过滤，用水洗数次，至滤液中无铁离子(Fe3+)为止，然后置于110℃烘箱中烘干。

1.2.3.2 测定方法在避光的条件下，称取100 g鲜余甘子果肉及吸取100 mL浓度为20 g/L草酸溶液，倒入捣碎机中打成匀浆，取0.2 g～1 g匀浆(含1 mg～2 mg抗坏血酸)倒入100 mL容量瓶中，用10 g/L草酸溶液稀释至刻度，混匀；过滤取25 mL滤液，加入2 g活性炭，振摇1 min，过滤，弃去最初数毫升滤液。取10 mL此氧化提取液，加入10 mL浓度为20 g/L硫脲溶液，混匀，此试样定为稀释液。

呈色反应：于三个试管中各加入4 mL稀释液。一个试管作为空白，在其余试管中加入1.0 mL浓度为20 g/L的2、4-二硝基苯肼溶液，再将所有试管放入(37±0.5)℃恒温箱或水浴中，保温3h后取出，除空白管外将所有试管放入冰水中。空白管取出使其变为室温，然后加入1.0 mL浓度为20 g/L的2、4-二硝基苯肼溶液，在室温中放置10 min～15 min后放入冰水内。其它步骤同其余3个试样。当试管放入冰水后，向每一试管加入85%硫酸5 mL，后将试管自冰水中取出，在室温放置30 min后比色。

标准曲线的绘制：加2 g活性炭于50 mL标准溶液中，振摇1 min，过滤，取10 mL滤液放入500 mL容量瓶中，加5.0 g硫脲，用10 g/L草酸溶液稀释至刻度、抗坏血酸(20 μg/mL)，取5，10，20，25，40，50，60 mL稀释液，分别放入7个100 mL容量瓶中，用10 g/L硫脲溶液稀释至刻度，使最后稀释液中抗坏血酸的浓度分别为1，2，4，5，8，10，12 μg/mL，按试样测定步骤形成脎并比色，以吸光值为纵坐标，抗坏血酸浓度(μg/mL)为横坐标绘制标准曲线。

(公式2)

式中：X——试样中总抗坏血酸含量，单位为毫克每百克(mg/100 g)。c——由标准曲线查得或由回归方程算得“试样氧化液”中总抗坏血酸的浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)。V——试样用10 g/L草酸溶液定容的体积，单位为毫升(mL)。F——试样氧化处理过程中的稀释倍数。m——试样的质量，单位为克(g)。计算结果表示小数点后两位。

2 结果与分析

7个不同产地的余甘子储藏前与储藏中相比，其没食子酸的含量变化均上升(见表1)；不同产地余甘子储藏前及储藏中比较，含维生素C量变化有5例呈上升趋势，2例呈下降趋势(见表2)；余甘子中SOD在不同产地储存前及储存中的活性变化在表中可以看出有5例活性减弱，2例活性增强(见表3)；结果显示，在余甘子储藏前及储藏中，与维生素C和SOD的变化相比，在余甘子储藏中，没食子酸含量上升的比例最为明显(见表1～3及图1)。

表1 滇橄榄不同产地储藏前及储藏中没食子酸含量的变化

表2 滇橄榄不同产地储藏前及储藏中维生素C含量的变化

表3 余甘子不同产地储藏前及储藏中SOD活性的变化

图与储存前相比储存中没食子酸含量变化的比率

没食子酸含量增多，可能因为采摘后发生呼吸跃变[5]，膜透性降低，果实多酚化合物与氧结合，导致余甘子中复杂的多酚化合物如单宁酸、五没食子酰基葡萄糖、槲皮素、糅花酸等发生分解反应使没食子酸从这些化合物中解离、脱落，致使没食子酸增多，并发生褐变[7～9]；Vc含量多为减少趋势，可能因为果实采摘后呼吸链发生断裂等环境变化导致Vc降解反应使其含量降低，或发生非酶褐变从而导致Vc含量的下降[10]；SOD活性多为降低的现象可能是采摘后呼吸链断裂使果实内部成分发生变化致使有机酸浓度升高、pH下降导致铜锌氧化酶铜离子解离、PPO逐渐失活引起SOD失活等，当采摘后由于褐变等一系列变化导致酶类分解，SOD活性降低[11]。部分余甘子采摘后SOD活性增高，可能是由于当地环境胁迫导致果实中产生大量的ROS的积累促使SOD活性增加。