核桃壳提取物体外抗氧化活性研究

2014-03-25郭瑜郝慧娟王晓闻任志远

山西农业大学学报（自然科学版） 2014年3期

郭瑜，郝慧娟，王晓闻，任志远

(山西农业大学食品科学与工程学院，山西太谷 030801)

核桃又名胡桃，具有很高的营养价值，在我国种植范围较广。山西是核桃的主要产区之一，有着丰富的核桃资源。近年来，随着核桃产品的大力开发产生了大量的核桃壳(约4～5×104t·y-1)[1]。核桃壳质地坚硬，可用于生产木炭、活性炭及过滤剂等[2～4]，目前核桃壳主要是被当做燃料使用，利用价值较低，有待进一步研究开发。

过多的自由基损害机体，研究认为，氧自由基是体内重要的一类活性自由基，包括O2-·、·OH、ROO·、RO·等。一般情况下，机体内的自由基能够进行正常的生理代谢，但当机体在非正常或是病变状态时，整个系统处于失衡的状态，自由基会使机体内大分子物质发生氧化反应，细胞结构和整体机能造成损坏，导致机体损伤，从而引起衰老及慢性疾病[5,6]。

胡博璐等[7]研究表明核桃壳的水提物可以有效的清除·OH；核桃壳的水、乙酸乙酯、正己烷提取物对亚油酸脂质过氧化具有抑制作用，表明核桃壳中存在抗氧化成分。张海珠等[8]对核桃壳NaOH提取物的研究表明，核桃壳中具有抑菌、杀菌成分。蓝晶晶等[9]研究表明核桃壳黑色素具有清除DPPH·、·OH、O2-·的能力。目前对核桃壳乙醇提取物的研究较少，因此以核桃壳醇提物及其氯仿相为研究对象，通过提取物对DPPH·、·OH、H2O2、O2-·的清除能力及总还原力的测定，对提取物的体外抗氧化能力进行评估。

1 材料与方法

1.1 试验材料

材料：核桃壳(山西省长治市平顺县)，经晾干后粉碎得到核桃壳粉末。

试剂：邻苯三酚、硫酸亚铁、水杨酸、铁氰化钾、氯化铁、氯化亚铁、无水甲醇、氯化钾、30%双氧水(北京化工，分析纯)；三氯乙酸、三氯甲烷、冰乙酸(天津市精细化工研究所，分析纯)；氯仿(天津市科密欧化学试剂有限公司，分析纯)；二苯代苦味酰肼自由基(DPPH·，美国Sigma公司)。

主要仪器：2100分光光度计(尤尼柯上海仪器公司)、R201D-11旋转蒸发仪 (郑州长城科工贸有限公司)、SHZ-III型循环水真空泵(上海亚荣生化仪器厂)

1.2 试验方法

1.2.1 核桃壳醇提物与氯仿相制备

核桃壳干燥后磨碎，以95%乙醇为浸提剂，按照料液比1∶24，浸提温度45℃，超声波功率250 W浸提1.4 h，过滤并减压浓缩，得乙醇提取物。提取物中加入一定量的蒸馏水，搅拌使其均匀分散，氯仿萃取，得氯仿相，减压浓缩。用甲醇将核桃壳乙醇浸膏和氯仿浸膏溶解，配制成不同浓度样液。

1.2.2 提取物对DPPH·清除能力

2.0 mL样液分别加入2.0 mL 0.125 mmol·L-1DPPH·(Sigma)和2.0 mL无水甲醇，摇匀，避光反应30 min，在517 nm处测定反应液的吸光度Ai、Aj；2.0 mL 0.125 mmol·L-1DPPH·加入甲醇2.0 mL，摇匀，避光反应30 min，在517 nm处测定反应液的吸光度A0。计算对DPPH·的清除率：

清除率/%=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

1.2.3 提取物的总还原能力

1 mL提取物中加入0.2 mol·L-1pH 6.6的磷酸缓冲溶液2.5 mL和质量分数1%的铁氰化钾2.5 mL，50℃水浴20 min。冰浴急速冷却后，加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL，3000 r·min-1离心10 min，取上清液1.0 mL，加入蒸馏水1.0 mL和质量分数0.1 % FeC130.2 mL，混匀，室温静置10 min，于波长700 nm处测定吸光度值，吸光度值越大则还原力越强。

1.2.4 提取物对H2O2清除能力

5 mL提取物中加入等量10 mmol·L-1的H2O2溶液(pH 7.4磷酸缓冲液为溶剂)混匀，230 nm处测吸光度值A1；以等量甲醇代替提取物测吸光度值A0；以等量磷酸缓冲液代替H2O2溶液测吸光度值A2。计算对H2O2清除能力：

清除率/%=[1-(A1-A2)/A0]×100%

1.2.5 提取物对·OH清除能力

按照表1加入反应试剂，摇匀，放入37℃水浴锅60 min后取出，于510 nm处测其吸光度值，计算对·OH的清除能力：

清除率/%=[1-(AX-AX0)/A0]×100%

表1 ·OH反应体系加样表

1.2.6 提取物对O2-·清除能力

100 μL样品液中加入0.1 mol·L-1的Tris-HCl缓冲液(pH 8.2，含4 mmol·L-1的EDTA)1.8 mL、1 mL双蒸水，25℃水浴保温10 min，加入25℃、3 mmol·L-1的邻苯三酚100 μL，迅速混合混匀，每隔30 s测定在325 nm处的吸光度值。以10 mmol·L-1的盐酸溶液配制空白管作为对照，测吸光度值。作吸光度随时间变化的回归方程，其斜率为邻苯三酚自氧化速率V，计算对O2-·的清除能力：

清除率/%=[(V对照-V样本)/V对照]×100%

式中：V对照-对照组邻苯三酚自氧化速率/ΔA·min-1；V样本-样品组邻苯三酚自氧化速率/ΔA·min-1。

2 结果与分析

2.1 提取物对DPPH·清除能力

由图1可见，核桃壳乙醇提取物和氯仿提取物对DPPH·自由基均有清除能力且清除能力随浓度的增加而增大。当溶液浓度在1 mg·mL-1以下时，醇提物对DPPH·的清除能力比氯仿相强。当溶液浓度达到1 mg·mL-1以上时，氯仿相的清除能力高于醇提物。在试验最大浓度2 mg·mL-1时，醇提物和氯仿相对DPPH·的清除2 mg·mL-1率分别达到84.91%和93.42%。

图1 提取物对DPPH·自由基的清除能力Fig.1 Scavenging ability of extracts on DPPH·

2.2 提取物总还原力的测定

由图2可见，核桃壳醇提物和氯仿相有一定的还原能力，且随浓度的增加还原能力增强。当样品浓度为2 mg·mL-1时，核桃壳乙醇提取物和氯仿相的还原力的吸光度分别达到1.971和0.998。

图2 提取物的还原能力Fig.2 Reducing power of extracts

2.3 提取物对H2O2清除能力

由图3可见，提取物对H2O2有一定的清除能力，且随浓度的增加清除能力增强。当浓度大于0.5 mg·mL-1时氯仿相对H2O2的清除率高于Vc和醇提物。当溶液浓度为2 mg·mL-1时，醇提物和氯仿相的清除率分别达到了33.54%和47.58%。

图3 提取物对H2O2清除能力Fig. 3 Scavenging ability of extracts on H2O2

2.4 提取物对·OH自由基清除能力

由图4可见，提取物具有清除·OH的能力，且随浓度的增加清除能力逐渐增强。当试验浓度达到2 mg·mL-1时，醇提物和醇提物氯仿相的清除率分别达到了22.98%和49.89%。在试验浓度范围内醇提物氯仿相的清除能力高于醇提物。

图4 核桃壳乙醇和氯仿提取物对·OH自由基清除能力Fig.4 Scavenging capacity of extracts on ·OH

2.5 提取物对O2-·清除能力

由图5可见，提取物具有清除O2-·的能力。当浓度为2 mg·mL-1时，醇提物和醇提物氯仿相的清除率分别为80.36%和90.64%。

图5 提取物对O2-·清除能力Fig.5 Scavenging capacity of extracts on O2-·

3 结论与讨论

3.1 体外抗氧化活性研究

二苯代苦味酰肼自由基(DPPH·)在517 nm处有最大吸收波长，其机理是释放质子，释放之后会形成一种稳定的反磁性分子。如果受试物能够清除DPPH·，便可以迅速的评价此受试物的抗氧化能力[6,10]。清除O2-·和·OH是抗氧化剂发挥抗氧化作用的主要机制。H2O2正常情况下在人的机体内不会发生化学变化，但一旦与羟基结合就会破坏人体的正常生理功能[11]。本试验结果显示在试验浓度范围内核桃壳乙醇相和氯仿相均对DPPH·、O2-·、·OH和H2O2有一定的清除能力，尤其对DPPH·和O2-·有较强的清除作用，而对·OH和H2O2清除作用不明显。

还原力是表示物质抗氧化能力的标志之一。溶液的吸光度越大，还原力也就越强，即抗氧化性也随之增强[12]。本试验结果表明核桃壳提取物在一定浓度下具有还原能力，在低浓度下还原能力比较低，随着浓度的增加，其还原能力逐渐上升。

在试验浓度范围内，核桃壳乙醇提取物和氯仿相对DPPH·、O2-·、·OH、H2O2的清除能力和还原能力与样品的浓度成正相关。本研究表明核桃壳乙醇提取物及氯仿相具有体外抗氧化能力。鉴于核桃壳多被弃置，如能从中提取活性成分，则可变废为宝，更充分、合理地利用资源。

3.2 核桃壳醇提物中的成分

卢四平等[13]人对核桃壳提取物的化学成分分析表明，核桃壳中含有有机酸、酚、酮等化合物，并含有一定的胡桃醌。孙墨珑[14]对核桃楸的醇提物进行了研究，确认了其中的活性成分主要为黄酮与胡桃醌。核桃与核桃楸同属胡桃属，因此根据孙墨珑与卢四平的研究推测本研究中核桃壳乙醇提取物中可能存在黄酮、胡桃醌。黄酮[15～17]具有抗氧化活性；胡桃醌具有抑菌[18,19]、抗肿瘤[20]等活性。核桃壳乙醇提取物表现出的体外抗氧化活性可能与其中黄酮、胡桃醌的存在及含量有关，具体需进一步研究验证。

参考文献

[1]常月梅.山西省核桃产业现状及发展前景[J].山西果树,2011,143(5):39-41.

[2]杨娟,丘克强.核桃壳真空化学活化制备活性炭[J].中南大学学报:自然科学版,2012,43(4):1233-1238.

[3]王立国,高从堦,王琳,等.核桃壳过滤-超滤工艺处理油田含油污水[J].石油化工高等学校学报,2006,19(2):23-26.

[4]钱翌,褚兴飞.核桃壳和花生壳在铅污染土壤治理中的应用[J].中国农学通报,2011,27(11):246-249.

[5]李艳伏，徐怀德，陈金海，等.木瓜蛋白酶酶解核桃粕蛋白产物抗氧化活性研究[J].中国食品学报,2008,8(5):8-14.

[6]黄忠仕,林兴,等.龙眼参粗多糖抗衰老作用的实验研究[J].中华现代中西医杂志,2004,2(2):97-98.

[7]胡博路,杭胡.核桃壳抗氧化和清除活性氧自由基的研究[J].食品工业科技，2002,3：15-16.

[8]张海珠，马媛，周萍.泡核桃壳提取物体外抗菌实验的初步研究[J].大理学院学报，2012,11(9):38-40.

[9]蓝晶晶，王建中，王丰俊.核桃壳和核桃青皮黑色素抗氧化性质的研究[J].食品工业科技，2012,33(15):108-111.

[10]朱艳华,谭军.玉米多肽抗氧化作用的研究[J].中国粮油学报,2008,23(1):36-38.

[11]裴凌鹏,董福慧,孔焕宇,等.核桃揪提取物改善老龄大鼠抗氧化功能的研究[J].北京中医药大学学报,2007,30(10):688-694.