应用均匀设计优化文冠果ISSR-PCR反应体系

张芸香,刘晶晶,白晋华,郭红彦,郭晋平

(山西农业大学 林学院,山西太谷 030801)

文冠果(XanthocerassorbifoliaBunge.)属无患子科文冠果属，落叶乔木和灌木，广泛分布于我国北方荒山坡地、沟谷间和丘陵地带，有较强的适应性和抗逆能力，根系发达、根蘖能力强，是优良的水土保持树种、园林绿化树种、蜜源植物和生物质能源树种[1，2]。

文冠果人工栽培的时间并不长，目前仍处于野生和半野生的状态。在长期的自然杂交下，文冠果群体内形成了许多类型，具有丰富的遗传多样性；产量良莠不齐，却存在着丰产性能好的优良单株[3，4]。因此，选择优良单株进行无性繁育，对优良单株进行无性系鉴定，找出经济性状(丰产性能)优异的无性系，培育出丰产性能好的品系(或品种)是当前非常迫切和艰巨的一项任务。

简单重复序列间扩增(Inter-Simplie Sequence Repeat，ISSR-PCR)是近年来在微卫星技术上发展起来的一类新型的分子标记技术[5]，具有多态性高，稳定性好，不需预知基因序列，检测速度快，产物特异性强，DNA用量少，技术要求低，技术成本低等特点[6]。现已被广泛应用于遗传多样性、品种鉴定、系统进化、基因定位、遗传图谱等方面的研究[7～11]。由于ISSR分子标记技术基于聚合酶链式反应Polymerase Chain Reaction，PCR[12]，其反应条件受模板DNA浓度、引物浓度、TaqDNA聚合酶浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度、退火温度等多个因素的影响。为保证结果的清晰、可靠和准确，减少实验的盲目性，必须对这些因素进行优化，构建特异性反应体系。为此，本研究采用均匀设计，对影响文冠果ISSR-PCR反应的引物浓度、TaqDNA聚合酶浓度、Mg2+浓度和dNTP浓度等4个主要因素在5个水平上进行优化试验，建立文冠果ISSR-PCR最佳反应体系，为今后PCR反应体系优化方法的选择提供参考。通过对文冠果基因组DNA的PCR扩增，淘汰无扩增带和扩增后条带不理想的引物，从中选取多态性高，条带清晰、重复性好、稳定性高的引物作为文冠果ISSR分析引物，同时结合对扩增反应循环次数的优化，获得文冠果ISSR-PCR反应的最佳扩增程序，为文冠果种质资源遗传多样性研究及系统保护提供借鉴与参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以文冠果实生苗幼叶为试验材料。种子采自山西省襄汾县苗圃，经冬季低温沙藏处理，春季种于花盆中，长出真叶后，用已灭菌剪刀剪取嫩叶，称取所需质量，用去离子水冲洗干净后，立即用于试验。

1.2 主要试剂及仪器

试验所用引物参照加拿大哥伦比亚大学(UBC)公布的第9套ISSR引物序列，由北京奥科生物工程公司合成。TaqDNA聚合酶、Mg2+和 dNTP购自天根生化科技有限公司。Marker采用BM 2000，购自天根生化科技有限公司。PCR反应在Biometra T1型PCR循环仪上进行。

1.3 基因组DNA提取

文冠果基因组DNA提取采用改良CTAB法[13]，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。稀释10倍后待用。

1.3.1 ISSR-PCR反应体系的正交试验设计及PCR扩增

选用20 μL体系，模板1 μL，2×PCR buffer，UBC815为引物，针对影响PCR反应的引物浓度、TaqDNA聚合酶浓度、Mg2+浓度和dNTP浓度4个因素，采用两轮均匀设计，对文冠果ISSR-PCR体系进行优化[14]。首先选用U20(54)均匀设计表，参加PCR反应的因素水平见表1，U20(54)均匀设计方案见表2。对第一轮试验结果进行分析，初步筛选出优化组合，并以此作为第2轮均匀设计的依据。第2轮均匀设计的因素和水平见表3，选用均匀设计表U12(34)进行试验(表4)。

表1 第一轮均匀设计因素与水平

表2 均匀设计U20(54)表

表3 第2轮均匀设计因素和水平

表4 均匀设计U12(34)表

1.3.2 ISSR-PCR 扩增程序优化

以第2轮均匀设计优化的反应体系为基础，对文冠果ISSR-PCR扩增程序中的循环次数进行筛选优化。扩增程序采用TaqDNA聚合酶推荐扩增程序，94℃预变性5 min，接着进行循环：94℃变性35 s，52～56℃退火35 s，72℃延伸45 s；循环结束后，72℃延伸10 min。循环次数设35、40、45 3个梯度。

2 结果与分析

2.1 ISSR-PCR体系的均匀优化

第一轮4因素5水平均匀设计共20个处理组合的ISSR-PCR体系的扩增结果见图1。

图1 第一轮均匀设计实验结果Fig.1 Amplification results of the initial uniform design注：M BM2000 Marker ；1～20 分别为表2中1～20处理。Note:M BM2000 Marker ；1～20 amplification results of treatment 1～20 in table 2.

从图1可见，不同水平组合的ISSR-PCR体系，扩增结果有差异。组合5、6、11、14、16没有扩增，组合1、2、19扩增带谱弥散，难以区分；组合4、7、8、10、20扩增带谱弱，扩增带少；组合3、9、13、15、18带谱模糊，有拖带现象，辨识困难，依稀可见带谱较多；组合12、17带谱明显，但有轻微拖带现象。结合扩增带谱的数目、强弱、清晰度等指标，组合12和17效果相对较好。为获得理想的ISSR-PCR体系，根据组合12和17对应的因素水平上，分别设计3水平(表3)，进行第二轮均匀设计筛选(表4)，扩增结果见图2。

由图2可见，12个组合中，组合3、4、9扩增带少且弱，效果差；组合1扩增带少，亮度大，条带不清晰；2、6、7、8、12扩增带少，亮度大，条带清晰；组合11扩增带多，亮度大，条带不清晰；组合5、10扩增带多，亮度大，条带清晰，效果较好。组合5(20 μL反应体系中，含dNTP 0.2 mmol·L-1、引物0.3 μmol·L-1、Mg2+2.5 mmol·L-1和0.4 UTaqDNA聚合酶)扩增条带多，带谱清晰，易分辨，被确定为第二轮均匀设计筛选结果。

2.2 循环次数对ISSR-PCR体系的影响

循环数是影响ISSR-PCR体系的重要因素，它决定了整个PCR反应的产量：循环数太少，PCR产物的量就低；循环数目多，产物相应地增加。理论上说，循环数越多，产物量越大，但实际到了反应平台期后，PCR产物不会有明显增加，反而引起非特异性扩增甚至无扩增[14]。

图2 第2轮均匀设计试验结果Fig.2 Amplification results of the secondary uniform design注：M BM2000 Marker ；1～12 分别为表4中1～12处理。Note:M BM2000 Marker ；1～12 amplification results of treatment 1～12 in table 4.

图3中，1～3分别为45、40和35次循环的ISSR-PCR扩增结果。由图3可见，循环次数为35次时，扩增带较弱，随着循环次数增加，扩增带亮度增加，即带谱由弱变强，表示扩增产物增加。循环次数为45次时，出现涂抹现象，扩增带减少，40个循环对于文冠果的ISSR-PCR扩增效果最好。

图3 不同循环次数ISSR-PCR扩增结果Fig.3 Amplification results of ISSR-PCR with different cycles注：M BM2000 Marker；1～3 分别表示循环次数为45,40,35。Note: M BM2000 Marker ；1～3 means 45 cycles，40 cycles，35 cycles，respectively.

3 讨论与结论

ISSR-PCR反应对模板浓度的要求范围较宽。冯富娟等在进行红松ISSR-PCR反应体系优化时证实模板纯度不会影响扩增结果，模板浓度在10～200 ng·μL-1之间扩增结果相同[6]。因此，本试验在进行优化时没有考虑模板纯度和浓度对反应体系的影响，而是将提取的模板DNA稀释10倍后取1μL后进行PCR扩增，取得了良好的扩增效果。

在PCR反应中，退火温度直接决定引物与模板DNA的特异性结合，不同的物种和引物有不同的退火温度，退火温度过低，引物与模板的结合性差，退火温度过高，非特异性扩增增加[15]。为此，使用不同引物时要对退火温度进行筛选，一般以引物的退火温度为标准±5 ℃，在此范围内，每2 ℃为一个梯度，进行退火梯度试验，得出试验所用引物的最佳退火温度，然后进行试验。

本试验采用U20(54)和U12(34)均匀设计表，对影响文冠果ISSR-PCR的4个主要因素进行筛选，得出在20μL体系中，四因素的最佳浓度分别为：dNTP 0.2 mmol·L-1、引物0.3 μmol·L-1、Mg2+2.5 mmol·L-1和TaqDNA聚合酶0.4 U。循环数为40时扩增效果最好。

参 考 文 献

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