芦笋ISSR引物筛选及遗传多样性分析

2014-03-25齐仙惠李改珍巫东堂

山西农业大学学报（自然科学版） 2014年3期

齐仙惠，李改珍，巫东堂

(1.山西农业大学园艺学院，山西太谷 030801；2.山西省农业科学院蔬菜研究所，山西太原 030031)

芦笋(AsparagusofficinalisL.)又叫石刁柏，多年生雌雄异株草本植物，营养丰富，药食同源[1]，是世界十大名菜之一[2]。近年来，随着人们对饮食健康的关注，芦笋这一保健蔬菜备受青睐，需求量也随之增长[3]。为确保芦笋产业的健康发展，应加大育种研究的力度。

近年来，DNA分子标记技术在植物育种研究中的应用越来越广泛，涉及植物品种鉴定、遗传作图、基因定位、遗传多样性等诸多方面。ISSR (inter-simple sequence repeat) 标记技术由加拿大蒙特利尔大学的Zietkiewicz等于1994年提出[4]，该方法操作简单，所显示的遗传多态性高且重复性好，已广泛应用于厚朴[5]、苦瓜[6]、牡丹[7]、长豇豆[8]等植物的研究。ISSR的引物具有通用性，但不同植物所需的引物有所不同，且就同一植物而言，不同引物的扩增效果也各有差异，因此需要从大量引物中筛选出适合供试物种PCR的引物。另外，同一引物用于不同植物的PCR时，其最佳退火温度也有差异，如引物815，在厚朴的ISSR-PCR中最佳退火温度为53.7℃，但在苦瓜、紫椴[9]中却分别为50.3和51.2℃；又如引物835，在厚朴、长豇豆、紫椴中的最佳退火温度分别为56.1、49.2和51.4℃。因此，在试验中有必要对引物进行最佳退火温度的筛选。

本试验以芦笋为供试材料，针对ISSR反应的特点，对不同引物及各种退火温度进行测试，筛选出适用于芦笋的引物及其最佳退火温度，并以此对收集自5个国家的26份芦笋品种进行ISSR分析。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

试验所用的芦笋材料均来自山西省农科院蔬菜所芦笋资源圃，分别收集自美国、荷兰、西班牙、加拿大及我国各地，共计26份，见表1。

表1 26份芦笋品种的名称及来源

为了提高试验效率，从前人的研究中初步筛选出了28个[10～12]ISSR引物(表2)，然后再对这些引物做进一步的筛选。所用28条ISSR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司根据哥伦比亚大学公布的引物序列合成。dNTPs、DNAmarker、Taq酶等试剂购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2 DNA提取与PCR反应体系及程序

采用小量CTAB法提取芦笋基因组DNA并做改良。用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，4℃保存备用。

ISSR-PCR基本反应体系为25 μL，其中包括：10×Buffer 2.5 μL，DNA模板2.0 μL，dNTPs(2.5 mmol·L-1)0.2 μL，引物(20 μmol·L-1)2.0 μL，Taq酶(5 U·μL-1) 0.1 μL，最后加入18.2 μL ddH2O补齐到25 μL。反应在PCR仪上进行，具体程序为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，设定温度退火1 min，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。

表2 初选出的28条供试引物

注：Y=嘧啶，R=嘌呤，B=无A，D=无C，H=无G，V=无T。

Note: Y=pyrimidine, R=purine, B=no A, D=no C, H=no G, V=no T.

1.3 引物筛选

选用来自不同国家的5个芦笋品种为供试材料，分别为：美国的Apollo、荷兰的Gijnlim、西班牙的Pacific Purple、加拿大的Mill和中国的冠军。以这5份芦笋基因组DNA为模板，设定退火温度为50℃，从初选出的28条ISSR引物中选出能扩增出多个清晰条带的引物。

1.4 最佳退火温度筛选

优化退火温度时以品种Apollo为样本，将温度梯度设为57～47℃，采用PCR仪自动生成的8个温度(57.0、56.3、55.1、53.3、51.0、49.3、47.9、47.0℃)对筛选出的引物进行不同退火温度下扩增效果的检验，遵照条带清晰和扩增位点多2个标准，筛选出最佳退火温度。

1.5 26份芦笋品种的ISSR分析

用筛选出的18条引物分别在最佳退火温度下对26份芦笋品种进行PCR扩增，用1.5%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，电泳缓冲液为1×TAE，电压为3 V·cm-1。电泳后在凝胶成像仪中观测结果并拍照保存。

2 结果与分析

2.1 ISSR引物的确定

根据引物筛选结果图确定适合芦笋ISSR-PCR的引物共18条(表2)，部分筛选结果见图1。由图1可见，第13、14、17、18泳道的扩增条带较好，第11、12、15、21泳道次之，第1、24泳道最差，几乎无可见条带。

图1 部分引物筛选结果Fig.1 Screening results of a part of primers注：1～24分别为：引物806、807、808、809、814、816、819、835、836、841、861、865、866、873、888、889、890、815、823、825、827、843、849、851。Note：1～24 are primer 806, 807, 808, 809, 814, 816, 819, 835, 836, 841, 861, 865, 866, 873, 888, 889, 890, 815, 823, 825, 827, 843, 849, 851.

2.2 最佳退火温度的确定

采用8个温度梯度对筛选出的18条引物进行退火温度优化，根据不同退火温度下的扩增效果确定各引物的最佳退火温度，引物823和827在不同退火温度下的扩增结果见图2、图3。

图2 引物823的退火温度梯度优化Fig.2 Gradient optimization of annealing temperature of primer 823注：1～8分别为57.0、56.3、55.1、53.3、51.0、49.3、47.9、47.0℃。图3同。Note:1～8 are 57.0, 56.3, 55.1, 53.3, 51.0, 49.3, 47.9, 47.0℃.The same as in Fig.3.

图3 引物827的退火温度梯度优化Fig.3 Gradient optimization of annealing temperature of primer 827

由图3可以看出，第8泳道的扩增条带数最多且条带清晰，因此该引物的最佳退火温度为47.0℃。18条引物的最佳退火温度结果见表3。从表3可以看出，不同引物间最佳退火温度差异较大，温度最高的是引物815、835、841、892，为57.0℃，温度最低的是引物873，为47.0℃，二者相差10℃。

2.3 ISSR-PCR扩增结果

用筛选出的18条ISSR引物对26份芦笋种质进行PCR扩增，扩增结果见表3。可以看出，这些引物对芦笋各品种的扩增效果虽然有差异，但多态性都较高。18条引物共扩增出DNA片段145条，其中多态性条带111条，多态性位点比例为76.6%。引物823对部分芦笋品种的扩增结果见图4。

表3 筛选出的18条引物及其扩增结果

图4 引物823对部分芦笋品种的扩增结果Fig.4 Amplification results of some varieties of asparagus with primer 823

2.4 聚类图分析

应用UPGMA对各芦笋品种的扩增结果进行相似系数分析，结果见图5。由图5可见，所有品种的遗传距离都大于零，且能够聚在一起，表明各芦笋种质资源之间具有相同的遗传背景，但相互之间也存在一定的差异。在相似系数0.78处划线，可将26份芦笋品种分为5个类群，第一类是4个美国品种和荷兰的Avalim，第二类是美国的Apollo、加拿大的Mill、荷兰的Fortems，共3个品种，第三类是西班牙的4个品种，第四类主要是荷兰和我国江西的一些品种，第五类是山东的097和0914。

从分类结果看，产地与聚类结果具有一定的相关性，如来源于江西的井冈红(17号)和JK102(19号)首先聚为一类，相似系数高达0.93。但不同国家的品种也可能表现出较高的相似性，如荷兰的Gijnlim(8号)和山东的TC(24号)。同时，同一国家的不同材料间也可能表现出较大的遗传多样性，如荷兰的Avalim(6号)和Gijnlim(8号)，分别聚在第1、4类群。

图5 芦笋种质资源的UPGMA聚类图(品种编号见表1)Fig.5 UPGMA tree of germplasm resources of asparagus (varieties numbers are in Table 1)

3 讨论与结论

不同植物所适用的ISSR引物有所不同，本试验筛选出适用于芦笋的引物共18条，并对其扩增效果进行了检测，所扩增出的条带数较多且清晰，能够显示出较强的遗传多样性，可用于芦笋遗传多样性的分析研究。

根据公式“Tm=4(G+C)+2(A+T)”和“最佳退火温度=Tm-5℃”可以推算出某一引物理论上的最佳退火温度，但同一引物在不同植物中的最佳退火温度不尽相同，且与理论值相差较大，甚至不具有明显的相关性[13]。本试验对所筛选出的引物进行了退火温度的梯度筛选，确定了它们的最佳退火温度，为今后芦笋的ISSR分子标记研究提供了参考。

本试验利用ISSR技术对26份芦笋材料进行分析，构建了聚类图，揭示了各品种之间的亲缘关系。试验的一些聚类结果与前人的研究相符，如在代真真[10]和李霞[14]的研究中，都有美国和荷兰一些品种亲缘关系接近的现象，本试验聚类结果中的第一类也是如此。芦笋作为雌雄异株植物，进化程度较高，即便是同一品种，个体间也可能存在遗传差异，因此，为了给芦笋育种工作提供更可靠的帮助，还应收集更多的种质资源，结合其他分子标记技术以及形态学等方法进行更深入的研究，以取得更大的研究成果。

参考文献

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