从水通道蛋白3介导的结肠水液代谢思考治疗慢性便秘的药物研究

占煜，陈泰宇，唐诗宇，刘芳，孔鹏飞，覃勤，唐学贵

(1.成都中医药大学，四川 成都 610072；2.川北医学院附属医院肛肠科，四川 南充 637000；3.川北医学院临床医学系，四川 南充 637000)

1 慢性便秘

1.1 慢性便秘的分类

便秘是常见的肠道症状，表现为排便次数减少，粪便干硬和(或)排便困难，病程在6个月以上称为慢性便秘(chronic constipation，CC)。CC的病因包括功能性、器质性疾病和药物等。功能性便秘(functional constipation，FC)病理生理机制未完全阐明，可能与结肠传输和排便障碍有关，目前主张将其分为慢传输型、排便障碍型(出口梗阻型)、混合型、正常传输型，其中混合型兼见慢传输型和排便障碍型的证据，正常传输型便秘多见于便秘型肠易激综合征(constipation-predominant irritable bowel syndrome，IBS-C)[1]。

1.2 慢性便秘治疗现状

CC尚无特异疗法，在调整生活方式的基础上，结合药物通便、生物反馈、外科手术等治疗手段缓解症状，恢复正常肠道动力以及排便功能为主要治疗目的。生物反馈对以排便障碍为主的CC患者疗效较好，可持续改善便秘症状、心理状况和生活质量[2-3]，但目前在国内应用有限。需外科手术的CC患者仅占少数，其他疗法如顺行灌洗、骶神经(电)刺激等还有待进一步研究。

药物治疗常作为主要或唯一治疗措施出现，具有重要地位。治疗便秘的药物很多，但多数不适于CC患者，亦不适宜长期应用，加之滥用泻药的现象普遍存在而造成不少医源性便秘，使得安全和长期有效对于药物治疗CC显得尤为重要。

治疗CC的药物分为：容积性泻药、刺激性泻药、渗透性泻药、润滑缓泻药、促动力药等。Lindberg等[3]认为，选用通便药应根据循证医学证据、安全性和药物依赖性等。盐类泻药大量使用可引起电解质紊乱，不适于老年人和肾功能减退者久用；长期使用刺激性泻药可能导致不可逆的肠神经损害[4]，且容易产生依赖性，加重便秘症状，甚至引起结肠黑变病；5-HT4受体激动剂作为胃肠促动力药的一大类别，部分制剂如替加色罗和西沙必利选择性较低，可导致严重心血管事件，国内外已停止用于治疗便秘。多项调查显示CC患者不满意现有的药物治疗，因排便费力等伴随症状未能改善[5-6]。可见，亟需研发新型通便药以补充现有药物治疗。

2 结肠水液代谢与慢性便秘

CC发病机制尚不完全清楚，可能与肠神经或肠神经递质异常、Cajal间质细胞异常、盆底功能障碍等有关。近年来，随着对消化道黏膜通道蛋白的研究深入，从肠道生理功能到各种病理改变均有了新的认识。

大多学者认为，肠道对水分的转运，包括吸收和分泌两方面，吸收功能的结构基础主要是肠上皮绒毛，与其毗邻的肠隐窝则负责分泌[7]；小肠是吸收和分泌的主要场所，结肠正常状态下不参与分泌，主要是吸收水分并向直肠推进脱水后的粪便，一般每日约有1.5 L的液体从小肠进入结肠，而最终排出的粪便含水0.2～0.4 L，若水分被过度吸收，可导致大便干结。结肠的分泌功能是由结肠隐窝细胞上Cl-通道调控，Cl-通道处于静息状态以保证对水和电解质的净吸收，而该类通道的异常可引起便秘或者腹泻[8-9]。基于Cl-通道对肠道分泌的调控作用，已出现以该类通道为靶点的药物，可刺激肠液分泌而促进排便，代表药物有鲁比前列酮(Lubiprostone)和利那洛肽(Linaclotide)，均在治疗CC患者的临床试验中显示出良好疗效及安全性，且在恢复自主排便和提高生活质量等方面具有优势[10-11]。此类肠道促分泌剂通过直接或间接激活细胞膜上的Cl-通道，使肠上皮细胞分泌Cl-，水和电解质伴随进入肠腔。据此，笔者及课题组成员思考是否能直接调节结肠水传输进而对CC产生治疗作用。

在胃肠道黏膜上皮细胞中，还存在另一类非常重要的通道蛋白——水通道蛋白(aquaporin，AQP)。研究证实结肠黏膜上皮细胞质膜上存在大量AQPs，并对水跨细胞运输起着不可忽视的作用，在肠道吸收和分泌、药物通便等水液代谢中扮演枢纽角色[12]。

3 水通道蛋白

3.1 水通道蛋白介导水运输

AQPs是一类具有特异孔道结构的跨膜蛋白，也称水孔蛋白，主要介导水分子和甘油分子的通透。迄今哺乳动物体内发现的AQP家族有13个亚型(AQP0-AQP12)，人体中主要分布于肾、脑、眼、消化道、腺体等组织和器官。

AQPs对水分子具有高度选择性，大部分AQPs严格排斥除水分子以外的其他物质通过，尤其是质子和离子，这一特性对膜电位平衡以及细胞内PH稳定十分关键。Kosinska等[13]采用超高分辨率技术揭示了水分子跨膜的整个运输过程，氢键形成、天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸(Asn-Pro-Ala，NPA)-标记序列以及由水分子形成的选择性过滤器可阻止质子随水分子通过细胞膜。

AQPs的发现为研究水跨膜运输的分子机制提供了新视角。研究表明许多生理病理过程均有AQPs参与，而干预AQPs功能与表达的制剂无疑对相关疾病具有潜在应用前景。位于肾集合管的AQP2受血管加压素(arginine vasopressin，AVP)影响而参与调节尿液浓缩，并与肾性尿崩症的发生有关[14]；AQP4大量分布于脑星形胶质细胞上，是调节大脑水平衡的重要蛋白，在脑水肿形成及消退中扮演关键角色[15]。某些其他疾病，如白内障、原发性干燥综合征、充血性心力衰竭等亦可见AQPs所介导水液代谢的异常。AQP3主要在肠道、肾脏和皮肤中表达，涉及一系列生理功能的正常运转。最近，多项研究提示AQP3在结肠水液代谢中的关键作用。

3.2 水通道蛋白3参与结肠吸收、分泌功能

通常认为肠道内水分吸收属于被动运输，以NaCl为主的各种溶质主动吸收所产生的渗透压梯度是吸收水的动力，且主要通过细胞间连接实现。肠上皮水运输有两种途径：细胞旁路和跨细胞通路，跨细胞通路又包括自由扩散、共同转运和AQPs通道三种方式，而结肠黏膜的电阻明显高于小肠，细胞旁路透水性较差，故跨细胞通路尤其是AQPs通道的重要性被越来越多的学者关注和认可。

研究显示，正常大鼠结肠中的AQPs主要是AQP3，大量分布于结肠黏膜上皮细胞的顶部和底侧部质膜上，其次为AQP1和AQP4，AQP1位于淋巴和血管周围，AQP4见于黏膜下层，AQP2和AQP8则很少[16-18]。另外，大鼠结肠AQP3的这一分布情况与人十分相似[19]。从AQPs分布情况可推测，AQP3与上皮细胞吸收、分泌功能密切相关。汞(Hg)是AQPs的特异性阻断剂(除AQP4外)，可能有两种机制阻止水的通透：一是单纯堵塞孔道[20]，二是使ar/R区域构象改变导致孔道坍塌[21]。生理情况下，肠腔内渗透压远低于血管内渗透压，水由肠腔进入血管即形成肠道对内容物的脱水作用。1.5 mM(1.5×10-3mol/L)HgCl2不改变大鼠肠腔渗透压、AQP3表达水平及分布等因素，而使粪便含水量上升约3倍，提示Hg2+通过阻断AQP3使水分留于肠腔而导致腹泻[16]，从侧面说明AQP3对结肠吸收水分的影响。敲除AQP3的Caco-2细胞表现出细胞旁路的透水性增强，这可能是跨细胞通路水运输减少的缘故[22]。

如前文所述，结肠分泌主要由Cl-通道调控，如囊性纤维化跨膜转导调节因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)。虽然尚无直接证据阐释AQP3或其他AQPs在Cl-通道介导结肠分泌中的作用，但有研究显示CFTR与AQP3可能存在某种合作机制[23]，有待进一步验证。

3.3 水通道蛋白3在药物通便中的作用

AQPs通道介导的运输同离子通道均属于被动运输，其运输方向由膜两侧的电化学梯度所决定。对于不带电的水分子来说，渗透压是决定其运输方向的唯一因素，另一方面，高渗刺激也可上调AQPs的mRNA表达和蛋白水平[24]，故一般认为渗透压是掌控水分子通透 AQPs的主要因素，亦是药物调节水液代谢的关键环节。近年来，随着多种离子和激素对结肠AQP3的调控得到证实，许多通便药的分子机制有了新的阐释。

盐类泻药MgSO4通过升高肠腔内渗透压，阻止结肠对水分的吸收，使肠内容物增大而刺激肠蠕动，产生迅速且剧烈的导泻作用。研究显示，给予大鼠MgSO4溶液2 h时结肠内渗透压达到最高，但此时腹泻并不明显，至4～8 h期间才观察到严重腹泻。AQP3蛋白水平的变化曲线能很好解释这一现象：2 h渗透压最高时，AQP3表达较少，不能满足水运输的需求，4～8 h渗透压较2 h下降，但由于AQP3表达增加使大量的水从血管运输至肠腔[17]。所以MgSO4致泻的关键环节可能不是升高渗透压，而是上调AQP3表达。近期研究发现：细胞内Mg2+浓度升高可激活AC-cAMP-PKA通路，触发反应元件(CREB)磷酸化，导致AQP3基因表达长期上调，为MgSO4导泻机制之一[25]。然而MgSO4所产生的高渗状态本身亦能刺激 AQP3上调，故渗透压是否仍对后期水运输起了决定性作用？另一项研究似乎能够说明问题。给予大鼠比沙可啶(促动力药)5 h时腹泻最强烈，此时渗透压未发生显著改变，AQP3蛋白水平约为空白对照组的20%；联合MgSO4+比沙可啶5 h时可使肠腔内渗透压显著升高， AQP3与单用比沙可啶相比无差异，其腹泻程度几乎等于单用比沙可啶[26]。上述结果提示：结肠内水传输的效率更取决于AQP3蛋白水平，而非渗透压。另外，传统认为比沙可啶(bisacodyl)的通便机制是产生PGE2抑制Na-K-ATP酶活性，肠腔Na+和K+浓度上升使渗透压升高，导致水分进入肠腔，但研究表明，比沙可啶是通过PGE2下调AQP3，阻碍结肠吸收水分而达到通便效应[18]。

综上，笔者及课题组成员认为：①AQP3是结肠吸收水分的重要通道；②通过调控细胞膜上AQP3的表达数目，从而调节水运输的效率，进一步对结肠内水液代谢产生影响，可能是众多药物通便的生物学基础。基于上述两点，以AQP3作为潜在靶点治疗CC具有较高研究价值。

4 以水通道蛋白3为潜在靶点展望中药研究

有关膜运输蛋白的研究早已成为生物化学、分子生物学、细胞生物学、药理学等多个领域中备受瞩目的焦点，而由于膜运输蛋白对细胞和机体生理功能的重要性，它们的激动剂或抑制剂已形成一个药物大类，如胰岛β细胞K+通道抑制剂用于治疗2型糖尿病、Ca2+通道抑制剂用于治疗高血压等，开发更多、更特异地作用于组织细胞上转运体或通道的药物，将有利于提高药物疗效及降低毒副作用[27]，其基础是对各种转运体和通道的分布、序列、构象、调控的更深入理解。

自1988年从人类红细胞膜上偶然发现AQP1始，2003年Agre因其对AQP作出的突出贡献而获得诺贝尔化学奖，至今二十余年间该领域取得了大量研究成果并推动了科学技术发展进步。尽管AQPs在动物与人体生理病理过程中的作用逐渐明了，以AQPs为靶点的制剂依然缺乏，目前已知的AQPs抑制剂，如汞、镍、铜、金化合物及异丙酚等，都因其毒性或低选择性而不能在体内应用。因此，发现特异性强的无毒或低毒化合物是此类药物的研发方向。今后，在治疗CC这一领域，以AQP3为潜在靶点，通过调控AQP3表达为主要作用机制的通便药研究具有应用前景，需要更多关于药效物质基础和信号转导机制的深入研究，未来还有很长的路要走。

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