复方鱼腥草对鲍曼不动杆菌体外培养生长的影响

蔡燕，韩雪梅，叶红，廖琪，汪聪亚，许媛1，，黄义山1，

(川北医学院 1.附属医院检验科；2.附属医院风湿免疫研究所；3.检验系，四川 南充 637000)

中国全国细菌耐药监测(Mohnarin)2011年度报告[1]中显示鲍曼不动杆菌的耐药率持续上升，亚胺培南和美罗培南的耐药率分别高达56.8%和58.7%；本院[2]2005年至2010年间分离的多重耐药鲍曼不动杆菌占79.24%，泛耐药菌株占17.20%。可见鲍曼不动杆菌感染给临床治疗带来很大的困难，目前被认为是危害全世界尤其是重症监护病房(intensive care unit，ICU)危重患者健康亟待解决的问题[3]。当前迫切需要研发新的抗菌药物来治疗其引起的重症感染。我国中草药中不少药物具有抗菌作用[4-6]。复方鱼腥草片含有鱼腥草、黄芩、板蓝根、连翘和金银花等，是一种复合中药制剂，在临床上主要用于感冒、咳嗽等，疗效显著。故本实验拟运用微量肉汤法稀释法和琼脂稀释法探讨复方鱼腥草对鲍曼不动杆菌生长的是否有影响，为临床上治疗鲍曼不动杆菌感染提供潜在新药。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 溶液配制 培养基：水解酪蛋白培养基即 MH(Mueller-H inton)肉汤，用去离子水稀释，高压灭菌备用。药物：复方鱼腥草片(0.41 g/片，海南海力制药有限公司生产)，去掉药片表面的糖衣，碾碎后用生理盐水配制为128 mg/mL备用。

1.1.2 菌株 采用美国得灵公司生产的NC21鉴定药敏板及配套试剂和Vitek-32进行菌株鉴定和药敏测定，从本院检验科微生物室 2013年11月9日至 2013年 11月19日临床分离的鲍曼不动杆菌株中筛选出20株菌株(其中含2株敏感菌株和18株对三类及以上药物耐药的多重耐药菌株)。并以鲍曼不动杆菌的标准菌株ATCC19606作为质控菌株。各菌株皆保存于-80 ℃备用。

1.1.3 仪器 Vitek Special DR100 Colorimeter(美国HACH COMPANY)调节菌悬液，采用美国恒温振荡水浴培养箱和恒温细菌培养箱培养细菌。

1.2 方法

1.2.1 菌液制备 复苏细菌：将冻存的各株鲍曼不动杆菌接种到MH平板上，35 ℃过夜培养。细菌扩增：挑取单菌落至1 mL肉汤中，35 ℃振荡培养12 h左右(根据既往经验，此时鲍曼不动杆菌可进入指数生长期)收集细菌。配制菌悬液：用生理盐水稀释各株鲍曼不动杆菌，采用Vitek Special DR100 Colorimeter调整各株细菌浓度为0.5麦氏单位(大约1×108cfu/mL)，并用MH肉汤按1∶1000稀释备用。

1.2.2 药物稀释 实验时各组药物的终浓度分别为：6 400 μg/mL、3 200 μg/mL、1 600 μg/mL、800 μg/mL、400 μg/mL、200 μg/mL。(1)微量肉汤稀释法：将128 mg/mL的复方鱼腥草素稀释10倍，各取100 μL加至96孔微量板相应孔中备用。(2)琼脂稀释法：将128 mg/mL的复方鱼腥草素稀释1倍为64 mg/mL，再依次倍比稀释为终浓度的10倍，各取1 000μL加至6 mm培养皿中，然后取9 mL经高压灭菌的MH琼脂分别加至相应的平板中，轻微摇匀，待凝固后放4 ℃冰箱中备用。

1.2.3 细菌培养 (1)微量肉汤稀释法：各取100 μL已稀释好的菌悬液接种到96孔微量板的相应孔中，同时设定不加药物和不加细菌的空白孔(只加MH肉汤)、不加药物的阳性细菌对照孔和不加细菌的阴性对照孔，每孔总量为200 μL， 不足者以 MH 培养基补入。每一药物浓度均做3个复孔。加样完毕后，将96孔板置恒温(35 ℃)水浴振荡培养箱中培养。(2)琼脂稀释法：将稀释好的菌液各取2 μL接种至含复方鱼腥草的平板，每株细菌、每一药物浓度各做 3个重复点，同时设定以细菌接种无药物的 MH平板作为细菌阳性对照和未接种细菌的阴性对照板。将平板置于 35 ℃细菌培养箱中培养。

1.2.4 结果检测 (1)微量稀释法：结果判定：培养>18 h后，将肉眼观察无细菌生长(培养孔中上清清澈，沉淀中仅见药物沉渣)的培养孔中的药物浓度作为相应菌株的最低抑菌浓度。(2)琼脂稀释法：培养18 h后，肉眼观察平板上细菌生长情况，记录各株细菌在不同浓度的药物平板上的生长情况。以无细菌生长的最低药物浓度作为该菌对应的MIC值。

2 结果

2.1 微量肉汤稀释法

培养18 h后观察：各株鲍曼不动杆菌的阳性对照孔皆有细菌生长，空白对照孔和不加细菌的阴性对照孔均无细菌生长，提示该实验结果真实可信。每株细菌在含有不同浓度药物的MH肉汤中生长均受到影响，随复方鱼腥草浓度的增加，细菌生长形成的浊度逐渐降低，所有菌株的最高药物浓度孔(6 400 μg/mL)中上清清澈，沉淀中仅见药物沉渣，部分菌株的3 200 μg/mL孔也未见细菌生长，即微量肉汤稀释法的MIC值为3 200～6 400 μg/mL。标准菌株ATCC19606的MIC值为3 200 μg/mL。

2.2 琼脂稀释法检测

肉眼观察见未加药物的阳性板上皆有菌落形成，而未接种细菌的阴性板上无细菌生长。6 400 μg/mL药物平板上皆无细菌生长。3 200～800 μg/mL的药物平板上有部分菌株生长，余各浓度的药物平板上皆有细菌生长。即MIC值为3 200～800 μg/mL。标准菌株ATCC19606的MIC值亦为3 200 μg/mL。

3 讨论

多重耐药菌(包括鲍曼不动杆菌)已经严重影响患者的安全和医院质量管理。《中国鲍曼部分杆菌感染诊治与防控专家共识》[7]中指出由于鲍曼不动杆菌具有快速获得和传播耐药性的能力，多重耐药、广泛耐药、全耐药鲍曼不动杆菌已呈世界性流行，不仅是我国最重要的“超级细菌”，更是全球抗感染领域的挑战。许多国家均采取一定的措施来抗耐药菌感染[8]。新药的研发远远赶不上细菌耐药的步伐，而中药抗感染的历史悠久，不易产生耐药性，而且不少中药还具有逆转细菌耐药等优点[9-10]，从现有的中药中寻找药物可能为临床上抗抗鲍曼不动杆菌感染的提供新的思路。

复方鱼腥草片含有鱼腥草、黄芩、板蓝根、连翘和金银花等，均为中草药中常见的抗感染治疗药物。刘如玉等[11]采用煮沸法分别对几味中药进行提取，发现这几味中药对铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌和嗜麦芽窄食单胞菌等均有不同程度的抑制作用。叶冠龙等[12]采用黄芩、连翘等的水煎剂也能体外抑制鲍曼不动杆菌的生长。复方鱼腥草片对急性咽炎、扁桃体炎等疗效显著，可能与其中的药物具有抗菌作用有关。本研究通过在21株鲍曼不动杆菌(包括标准菌株ATCC19606)中重复 3次后的实验结果显示：复方鱼腥草片对鲍曼不动杆菌的生长具有抑制作用；选取的20株鲍曼不动杆菌中含2株敏感株，18株多重耐药株，敏感株和耐药株的生长皆受到复方鱼腥草的影响，耐药株和敏感株的MIC值间无差别。苏显中等[13]分析了鲍曼不杆菌标准菌株ATCC19606的耐药性和耐药基因，发现该菌株对链霉素、诺氟沙星、氯霉素、红霉素、四环素和氨苄西林等均有很高的耐药性，有多种耐药机制参与其耐药。复方鱼腥草对ATCC19606也有一定的抗菌作用。鲍曼不动杆菌可通过产生抗菌药物灭活酶、改变药物作用靶位、减少到作用靶位的药物量等方式对现有的抗生素产生耐药性，而本实验中所有耐药菌株的生长被复方鱼腥草抑制，说明鲍曼不动杆菌的这些耐药机制对复方鱼腥草无影响。提示复方鱼腥草可作为抗鲍曼不动杆菌(即使是多重耐药菌株)感染的潜在药物。但其具体作用机制及其与现有抗生素之间的协同作用尚待进一步研究。

【参考文献】

[1] 肖永红，沈萍，魏泽庆，等.Mohnarin 2011年度全国细菌耐药监测[J].中华医院感染学杂志，2012，22(22)：4946-4952.

[2] 黄义山，白珊珊，黄佳佳.2005年至2010年临床常见病原菌的回顾性分析[J].川北医学院学报，2013，28(1)：55-59.

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[7] 陈佰义，何礼贤，胡必杰，等.中国鲍曼不动杆菌感染诊治与防控专家共识[J].中国医药科学，2012，2(8)：3-8.

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[11] 刘如玉，陈守涛．黄连，等.8种中药对常引起医院内感染的条件致病菌体外抗菌活性检测[J].福建中医学院学报，2004，14(20)：26-28.

[12] 叶冠龙，陈峰.黄芩、连翘等中草药对鲍曼不动杆菌体外抑菌作用的研究与分析[J].陕西中医，2013，34(11)：1559-1560.

[13] 苏显中，张兴，陈彦，等.鲍曼不动杆菌ATCC19606多重耐性分析及耐药基因的克隆[J].中国抗生素杂志，2006，31(11)：688-691.