替莫唑胺联合粉防己碱对人脑胶质瘤U87细胞的抑制作用

张 勇，马继伟，李海莹，王绍祥，3，闫雍容，刘子豪，杜 彬，钟雪云

（暨南大学1．医学院病理教研室，2．广东省分子免疫与抗体工程重点实验室，3．生物医药研究开发基地广东省生物工程药物重点实验室，广东广州 510632）

ZHANG Yong1，2，MA Ji-wei1，2，LIU Hai-ying1，2，WANG Shao-Xiang1，2，3，YAN Yong-rong1，2，LIU Zi-hao1，2，DU Bin1，2，ZHONG Xue-yun1，2

（1．Departm ent o f Patho logy，Medica l Co llege，2．Guangdong Provincia l Key Laboratory o f Mo lecu lar Immunology and Antibody Engineering，3．Guangzhou Jinan Biomedicine Research and Development Center，Guangdong Provincial Key Laboratory of Bioengineering Medicine，Jinan University，Guangzhou 510632，China）

替莫唑胺联合粉防己碱对人脑胶质瘤U87细胞的抑制作用

张 勇1，2，马继伟1，2，李海莹1，2，王绍祥1，2，3，闫雍容1，2，刘子豪1，2，杜 彬1，2，钟雪云1，2

（暨南大学1．医学院病理教研室，2．广东省分子免疫与抗体工程重点实验室，3．生物医药研究开发基地广东省生物工程药物重点实验室，广东广州 510632）

目的探讨粉防己碱与替莫唑胺联合用药对人脑胶质瘤细胞U87细胞存活、克隆形成、迁移能力及凋亡的影响。方法 采用CCK-8法检测粉防己碱8～64μmol·L－1，或替莫唑胺50～400μmol·L－1，或替莫唑胺＋粉防己碱3．2和6．4μmol·L－1作用24 h后细胞存活率。粉防己碱6．4μmol·L－1、替莫唑胺100μm o l·L－1或替莫唑胺＋粉防己碱3．2和6．4μm o l·L－1作用24 h后，Giem sa染色检测细胞的克隆形成；Transwell小室检测细胞迁移能力；流式细胞术AnnexinⅤ／PI双染法检测细胞凋亡；W estern蛋白质印迹法检测Bcl-XL、活化胱天蛋白酶3及活化聚ADP核糖聚合酶（PARP）蛋白表达。结果 CCK-8实验结果显示，单用粉防己碱和替莫唑胺均能抑制U87细胞的生长，且具有浓度依赖性（r＝0．903，P＜0．05），替莫唑胺100μm ol·L－1＋粉防己碱3．2和6．4μm o l·L－1抑制率高于两药单用，经分析两者作用为相加。替莫唑胺可抑制U87细胞的克隆形成和迁移能力，两药联用时比单用替莫唑胺抑制作用更明显（P＜0．05）；与单用替莫唑胺相比，两药联用时抗凋亡蛋白Bcl-XL明显减少，执行凋亡的活化的剪切胱天蛋白酶3蛋白及剪切PARP明显增多。结论 粉防己碱联用替莫唑胺能明显抑制人脑胶质瘤U87细胞的生长、克隆形成及迁移能力，并诱导激活胱天蛋白酶3依赖的细胞凋亡。

粉防己碱；替莫唑胺；U87细胞；细胞凋亡

DO l：10．3867／j．issn．1000-3002．2014．03．010

脑胶质瘤是最常见的中枢神经系统疾病之一，其中脑胶质母细胞瘤的恶性程度最高，为WHOⅣ级，具有组织异型性和侵袭性，复发率很高，且生存率往往不到1年。因此，迫切需要发展新的治疗方法和药物，进一步改善脑胶质瘤的患者生存质量、延长生存率。粉防己碱（tetrandrine，TET）来源于防己科植物粉防己的根，研究表明，TET具有抗癌作用，包括乳腺癌、食管癌、鼻咽癌、结肠癌、肺癌、肝癌、成神经细胞瘤及脑胶质瘤［1］。TET联合化疗药物紫杉醇对人胃癌细胞MKN-45的增殖抑制及凋亡诱导有良好的协同效应［2］。体内研究报道，TET可降低大鼠胶质瘤生长速率，延长荷瘤大鼠生存时间，对大鼠皮下和脑内胶质瘤均具有抗癌作用［3］。替莫唑胺（temozolom ide，TMZ）以其高脂溶性和易于通过血脑屏障的特性，是化疗的首选药物，其不良反应轻，广泛用于临床［4］。虽然TMZ的应用在一定程度上改善了脑胶质瘤患者的预后，但是其单独用药的有效率仍然有待提高，且单用时会导致脑胶质瘤耐药的产生，限制了其临床效果，因此，寻找TMZ的联合用药策略，对于增强脑胶质瘤化疗效果、改善患者生存质量、减少胶质瘤复发都尤为重要。

TET是属双苄基异喹啉类化合物，具有抗炎、免疫抑制［5］及抗癌作用。研究表明，TET多通过促进细胞凋亡、抑制其增殖来实现抗癌作用，且大部分的促凋亡和抑制增殖的作用呈时间及浓度依赖性［6］，其促凋亡作用主要通过线粒体通路诱导细胞凋亡。但关于TET对人脑胶质瘤的临床疗效的文献还比较局限，其具体的抗胶质瘤作用机制及与其他药物或治疗方法的联用效果，都有待更深入的研究。本研究通过TMZ联合应用TET，探讨它们对人脑胶质瘤U87细胞增殖生长等生物学行为的影响，为临床治疗脑胶质瘤联合用药提供实验依据。

1 材料与方法

1．1 药物、试剂及主要仪器

TET及TMZ购自美国Sigm a公司，人脑胶质瘤细胞系U87购自上海中科院细胞库，细胞复苏后置于DMEM完全培养基中，37℃，5%CO2，95%湿度培养箱中培养；二甲亚砜（DMSO）、胰蛋白酶（trypsin，1∶250）购自美国Sigma公司；AnnexinⅤ／PI双染试剂盒购自北京宝赛生物技术公司；CCK-8（cell count kit-8）细胞计数试剂购自日本同仁化学研究所；Transwell小室购自美国Corning公司；β肌动蛋白（克隆号13E5），Bc l-XL（克隆号54H6），活化多聚二磷酸腺苷-核糖聚合酶〔poly（ADP-ribose）polymerase，PARP；克隆号Asp214，D64E10〕，活化胱天蛋白酶3（克隆号D175，5A1E）抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司；化学发光试剂（ECL）购自美国Pierce公司；Olym pus倒置显微镜，日本；流式细胞仪，BDFACScantoTM，美国。

1．2 CCK-8法检测细胞存活

取对数生长期的U87细胞，调成每孔5000个的细胞悬液接种于96孔板，每孔100μL，置于37℃，5%CO2，95%湿度培养箱中培养24 h后去上清，分别加入TET 8，16，32，48和64μm o l·L－1或TMZ 50，100，200，300和400μmol·L－1及浓度梯度的TMZ＋TET 3．2或6．4μmo l·L－1，同时设正常对照组，每组5复孔。各组用DMEM培养基培养24 h后，每孔加入10μL CCK-8试剂，继续培养1 h，酶标仪检测吸光度值（A）（测定波长450 nm，参比波长655 nm），计算各组细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率（%）＝（1－A实验组／A对照组）×100%。

1．3 克隆形成实验

取对数生长期的U87细胞，调成每孔800个细胞悬液接种于6孔板，培养24 h后分别加入TMZ 100μm o l·L－1，TET 6．4μm o l·L－1，TMZ联合TET 3．2和6．4μmol·L－1，终体积为每孔2 m L，正常组加入DMSO作为对照，培养7 d后，吸去培养液，PBS洗涤2次后，4%多聚甲醛固定液固定10 m in后晾干，吉姆萨染液染色15 m in后流水冲洗晾干，倒置显微镜下计数细胞克隆（＞20细胞为1个克隆）并拍照，IPP采集图像分析。克隆形成抑制率（%）＝（1－实验组细胞克隆数／对照组细胞克隆数）×100%。

1．4 Transw ell实验检测细胞迁移能力

在Transwe ll下室中加入含10%胎牛血清的DMEM培养基600μL，待检细胞饥饿处理12 h以无血清DMEM培养基制成单细胞悬液，按1．3项分组处理的100μL细胞悬液种于上室，置于37℃，5%CO2，95%湿度培养箱中培养24 h后取出小室，弃去小室内培养液，湿棉签擦去上面未穿过微孔的细胞，4%多聚甲醛固定1 h，风干后置于0．1%结晶紫中染色1 h，倒置显微镜下观察。随机取5个视野，计数每个视野内的穿过微孔的细胞数，以迁移细胞的相对数目来表示肿瘤细胞的侵袭能力，迁移抑制率（%）＝（1－实验组侵袭细胞数／对照组侵袭细胞数）×100%。

1．5 AnnexinⅤ／Pl双染法检测细胞凋亡

取对数生长期细胞接种于6孔培养板过夜，弃上清，按1．3项分组处理的细胞每组设3复孔。培养48 h后，PBS洗涤细胞3次，按试剂盒说明书分别加入AnnexinⅤ-FITC和PI，4℃避光反应30 m in，再加入300μL结合缓冲液，流式细胞仪检测细胞凋亡。

1．6 Western蛋白质印迹法检测Bc l-XL，活化多聚二磷酸腺苷-核糖聚合酶及活化胱天蛋白酶3表达

将1．3项处理后的细胞，用PBS冲洗，冰上充分裂解后，置于4℃，13 400×g离心30 m in，取上清液，测定蛋白含量，加入上样缓冲液沸水中煮沸5 m in，进行SDS-PAGE电泳。300 m A恒流转膜；膜封闭1 h，然后加一抗在4℃孵育过夜。次日加二抗于摇床室温孵育1 h，然后经ECL发光试剂（Pierce）显影，最后于暗室X线胶片感光。以目标蛋白与内标的积分吸光度的比值表示蛋白相对表达量。

1．7 统计学分析

2 结果

2．1 粉防己碱及其与替莫唑胺联合应用对U87细胞存活的影响

如图1所示，单用TET或TMZ对U87细胞存活有抑制作用，抑制率与药物浓度呈正相关（r＝0．903，P＜0．05；r＝0．995，P＜0．05），TET和TMZ对人脑胶质瘤U87细胞的IC50分别为（20．91± 3．71）μmol·L－1和（292．15±8．36）μmol·L－1。采用抑制率＜30%的浓度进行药物的联合实验，如图1B，TMZ＋TET 3．2和6．4μm o l·L－1，其抑制率较单用 TMZ有下调趋势，尤其当 TMZ＜200μmol·L－1效果更为明显。当TMZ浓度为50和100μmo l·L－1时，两者联合用药抑制细胞存活作用比单用TMZ更明显。经计算分析表明，TMZ 100μmol·L－1＋TET 6．4μmol·L－1时，CI＝1．049，说明两药为叠加作用。

Fig．1 Effect o f tetrand rine（TET）alone or in combination w ith temozo lom ide（TMZ）on U87 cell grow th．The cell viability was performed with a CCK-8 assay when U87 cells were treated with TET，TMZ and TMZ combined w ith TET for24 h．，n＝5．*P＜0．05，compared with TMZ 0μmol·L－1group；＃P＜0．05，compared with TMZ group of the same concentration．

2．2 粉防己碱与替莫唑胺联合应用对U87细胞克隆形成的影响

与正常对照组相比，单用TET 6．4μm o l·L－1或 TMZ 100μm o l·L－1处理细胞克隆有减少趋势，抑制率分别为（30．2±2．4）%，（28．2±1．4）%；与单用TET及TMZ组相比，TMZ＋TET 3．2和6．4μmol·L－1组细胞克隆明显减少（P＜0．05），其抑制率分别为（69．1±2．1）%和（76．5±2．0）%，表明TET合用TMZ能有效抑制U87细胞增殖。

2．3 粉防己碱与替莫唑胺联合应用对U87细胞迁移能力的影响

Transwe ll小室迁移实验结果（图2）显示，TMZ 100μm o l·L－1组、TET 6．4μm o l·L－1组、TMZ＋TET 3．2和6．4μmol·L－1组细胞迁移抑制率分别为（9．4±1．4）%，（12．9±1．0）%，（29．2± 1．6）%和（46．8±3．4）%，表明与单用TET组及TMZ组相比，TET合用TMZ能有效减弱U87细胞迁移能力（P＜0．05）。

Fig．2 Effec t o f TMZ com bined w ith TET on m ig ration ability o f U87 cells after 24 h treatm en t by transw e ll assay（×100）．A：normalcontrol；B：TMZ 100μm ol·L－1；C：TET 6．4μmol·L－1；D：TMZ 100μmol·L－1＋TET 3．2μmol·L－1；E：TMZ 100μmol·L－1＋TET 6．4μmol·L－1．Arrwos show the migrating cells．

2．4 粉防己碱与替莫唑胺联合应用对U87细胞凋亡的影响

AnnexinⅤ／PI双染流式细胞仪检测结果显示（图3和表1），与单用TET及TMZ组相比，TMZ＋TET 3．2和6．4μmol·L－1组细胞早期凋亡率和晚期凋亡及坏死率均明显增多（P＜0．05，P＜0．01），表明TET合用TMZ能促进U87细胞凋亡。

Fig．3 Effect o f TET combined w ith TMZ on U87 cell apop tosis detected by flow cytometry after 48 h treatm en t．A：norm al control；B：TMZ 100μmol·L－1；C：TET 6．4μmol·L－1group；D：TMZ＋TET 3．2μm ol·L－1group；E：TMZ＋TET 6．4μm ol·L－1group．

Tab．1 Effect o f TET combined w ith TMZ on U87 apop tosis

2．5 粉防己碱与替莫唑胺联合应用对U87细胞凋亡相关蛋白的影响

Western蛋白质印迹法结果（图4）显示，TMZ组的抗凋亡蛋白Bcl-XL，活化胱天蛋白酶3及活化PARP变化不明显；TET组的抗凋亡蛋白Bcl-XL表达减少，活化PARP表达增多；与单用TET组及TMZ组相比，TMZ＋TET 3．2和6．4μmol·L－1组，抗凋亡蛋白Bc l-XL明显减少，执行凋亡的活化胱天蛋白酶3蛋白及活化PARP明显增多（P＜0．05）。

Fig．4 E ffec t o f TET com bined w ith TMZ on p ro tein exp ression o f U87 ce lls detec ted by Western b lo tting after 48 h treatment．C-PARP：cleaved poly（ADP-ribose）polymerase．Lane 1：normal control；lane 2：TMZ 100μmol·L－1；lane 3：TET 6．4μmol·L－1；lane 4：TMZ 100＋TET 3．2μmol·L－1；lane 5：TMZ 100μmol·L－1＋TET 6．4μmol·L－1．B was the semi-quantitative resultof A．，n＝3．*P＜0．05，**P＜0．01，com pared with normal control group；＃P＜0．05，＃＃P＜0．01，com pared w ith TMZ group；△P＜0．05，△△P＜0．01，compared with TET group．

3 讨论

本研究结果表明，TET联合TMZ能抑制U87细胞增殖，减弱其细胞迁移能力，促进细胞凋亡。有报道发现，在人白血病细胞U937中，TET通过诱导细胞内活性氧的产生，从而激活JNK和胱天蛋白酶，促进细胞凋亡［8］；在人肝母细胞瘤HepG2细胞株中，TET上调p53，激活胱天蛋白酶3及胱天蛋白酶9，剪切PARP（cleaved-PARP，C-PARP），下调抑制凋亡的蛋白Bcl-XL和Bcl-2的表达，表明TET主要通过线粒体途径诱导细胞凋亡发挥抗肿瘤作用［9］。

尽管如此，有研究表明，TET可下调耐药蛋白P-糖蛋白介导的药物外排来逆转多药耐药从而发挥抗肿瘤作用。比如，TET逆转人乳腺癌多药耐药细胞MCF-7／adr对多柔比星的耐药［10］；还可逆转人口腔鳞癌多药耐药细胞KBv200对紫杉醇的耐药［11］。此外，在人食管鳞癌顺铂耐药细胞YES-2／DDP中，TET还可通过抑制多药耐药相关蛋白MRP1，逆转细胞对顺铂的耐药［12］。在人脑恶性胶质瘤U138MG中，TET还可以通过增强其放疗效果来发挥抗胶质瘤作用［13］。这些TET逆转耐药和增效作用的研究为TMZ联用TET提供了一定理论依据。本研究中，TET联合运用TMZ处理人脑胶质瘤U87细胞时，比两药单用能更好地抑制U87细胞生长、克隆形成和迁移能力等。通过流式细胞仪检测凋亡，两者联合用药比两药单用更能促进U87细胞凋亡。Western蛋白质印迹法检测凋亡蛋白发现，TET可能通过参与下调细胞内抗凋亡蛋白Bcl-XL，上调活化胱天蛋白酶3，从而剪切的DNA修复酶PARP增多，诱导活化胱天蛋白酶3依赖的细胞凋亡。这其中，两药联用促进U87细胞凋亡作用可能与其下调耐药相关蛋白有关，尚需要进一步深入研究。因此，在胶质瘤细胞系中，建立多药耐药蛋白高表达的细胞株，进一步研究TET对其生物学行为的影响及分子机制显得更有研究价值。

综上所述，TET联合运用TMZ能明显抑制人脑胶质瘤U87细胞的存活、克隆形成及迁移能力，并诱导胱天蛋白酶3依赖的细胞凋亡。这提示TMZ联合TET可能成为胶质瘤临床化疗过程中候选治疗措施，将提高胶质瘤化疗效果和抗胶质瘤治疗提供参考。

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lnhibito ry effect o f tem ozo lom ide com bined w ith tetrand rine on hum an g liob lastom a U87 cells

OBJECTlVETo observe the e ffect o f tem ozo lom ide（TMZ）in com bination w ith tetrand rine（TET）on cell viability，colony formation，m igration and ce ll apoptosis of human g lioblastom a U87 ce lls．METHODSThe viability o f U87 ce lls treated w ith TET（8－64μm o l·L－1），TMZ（50－400μm o l·L－1）and TMZ com bined w ith TET（3．2，6．4μm o l·L－1）was detected by cytotoxicity assays w ith Cell Counting Kit-8（CCK-8），the co lony form ation was detected by Giem sa staining，ce llm igration ability was detected by Transwellm igration assay，cell apoptosis was assayed by flow cytometry using AnnexinⅤ／PIdouble staining，and the expression of apoptosis-related proteins expression was detected by Western blotting．RESULTSThe data of CCK-8 showed that TET（r＝0．903，P＜0．05）or TMZ（r＝0．995，P＜0．05）could inhibitU87 cellviability alone in a concentration-dependentmanner．The cell viability inhibition rate of U87 ce lls by TMZ combined w ith TET was higher than by TMZ or TET a lone．Data showed that the e ffect o f TMZ combined w ith TET was additive．TMZ 100μm ol·L－1inhibited U87 ce ll co lony formation and m igration ab lility com pared w ith norm a l contro l．The inhibition rate o f U87 cells by TMZ 100μmo l·L－1com bined w ith TET（3．2 and 6．4μm ol·L－1）was m ore significant than by TMZ a lone（P＜0．05）．Compared w ith TMZ a lone，TMZ com bined w ith TET（3．2 and 6．4μm o l·L－1）significantly down-regulated the expression of anti-apoptotic protein Bcl-XL，but significantly up-regulated the expression of cleaved caspase 3 protein and cleaved poly（ADP-ribose）polymerase．CONCLUSlONTET combined with TMZ can inhibit U87 cell viability，colony formation and m igration by activating caspase-dependent apoptotic pathway，resulting in apoptosis．

tetrand rine；tem ozo lom ide；U87 cells；apop tosis

ZHONG Xue-yun，E-mail：tzxy＠jnu．edu．cn，Tel：（020）85228363

ZHANG Yong1，2，MA Ji-wei1，2，LIU Hai-ying1，2，WANG Shao-Xiang1，2，3，YAN Yong-rong1，2，LIU Zi-hao1，2，DU Bin1，2，ZHONG Xue-yun1，2

（1．Departm ent o f Patho logy，Medica l Co llege，2．Guangdong Provincia l Key Laboratory o f Mo lecu lar Immunology and Antibody Engineering，3．Guangzhou Jinan Biomedicine Research and Development Center，Guangdong Provincial Key Laboratory of Bioengineering Medicine，Jinan University，Guangzhou 510632，China）

R285，R966

：1000-3002（2014）03-0367-06

Foundation item：The project supported by NationalNatural Science Foundation of China（81072059）；and Science and Technology Innovation Key Project of Guangdong Higher Education Institutes（CXZD1110）

2013-11-06 接受日期：2014-03-12）

（本文编辑：乔 虹）

国家自然科学基金项目（81072059）；广东省高等学校科技创新重点项目（CXZD1110）

张 勇，硕士，主要从事肿瘤病理及胶质瘤干细胞相关耐药机制研究。

钟雪云，E-mail：tzxy＠jnu．edu．cn，Tel：（020）85228363