T-2毒素对小鼠胚胎干细胞线粒体功能的抑制作用

方海琴，李利忠，赵增明，何 俊，赵 君，杨 嵘，耿 雪，彭双清

（1．军事医学科学院疾病预防控制研究所毒理学评价研究中心，北京 100071；2．国家食品安全风险评估中心卫生部食品安全风险评估重点实验室，北京 100021）

T-2毒素对小鼠胚胎干细胞线粒体功能的抑制作用

方海琴1，2，李利忠1，赵增明1，何 俊1，赵 君1，杨 嵘1，耿 雪2，彭双清1

（1．军事医学科学院疾病预防控制研究所毒理学评价研究中心，北京 100071；2．国家食品安全风险评估中心卫生部食品安全风险评估重点实验室，北京 100021）

目的观察T-2毒素对小鼠胚胎干细胞（m ESC）线粒体功能的毒性作用，探讨其胚胎毒性的可能作用靶点与作用机制。方法处于分化过程中的m ESC加入T-2 0．5μg·L－1分别作用24，72及120 h，同时设Trolox 200μmol·L－1预处理后30 m in再加入T-2毒素0．5μg·L－1染毒72 h组。透射电子显微镜观察线粒体内结构；罗丹明123荧光探针法流式细胞术检测mESC内线粒体膜电位，氧电极法检测线粒体呼吸速率，计算呼吸控制比，荧光素-荧光素酶发光法测定ATP合成酶活性。结果透射电镜观察可见，T-2 0．5μg·L－1作用72与120 h组m ESC内线粒体数量明显减少，结构变形，线粒体中少见或缺少完整的嵴，与正常对照组相比，mESC内线粒体呼吸控制比分别下降49．5%和55．1%（P＜0．05），ATP合成酶活性分别下降84．9%和89．3%（P＜0．05），m ESC线粒体膜电位下降23．2%和35．2%（P＜0．05）。Trolox预处理可以改善T-2毒素对上述线粒体功能指标的抑制作用。结论T-2毒素可降低m ESC的线粒体功能，进而抑制m ESC的分化能力，可能是其胚胎发育毒性的作用机制之一。

T-2毒素；毒性作用；胚胎干细胞；线粒体；细胞分化

DO l：10．3867／j．issn．1000-3002．2014．03．018

T-2毒素是一种由三线镰刀菌产生的单端孢霉烯族毒素，广泛分布于自然界，尤其对粮谷作物的污染范围广程度重。经食物连续摄入T-2毒素会对人类和动物的健康造成严重危害，表现出对生殖发育系统的母体毒性和胎仔毒性，可导致胚胎发育异常，甚至死亡［1－2］。

胚胎干细胞实验（embryonic stem cell test，EST）作为欧洲替代方法验证中心（European Centre for the Va lidation o f Alternative Methods，ECVAM）正式批准为体外发育毒性筛选的动物替代方法，EST可以从细胞毒性、分化抑制以及分子生物学水平反映发育毒性，其中受试物对ESC向心肌细胞分化的半数抑制浓度ID50可反映受试物对胚胎干细胞（em bryonic stem ce ll，ESC）分化过程的影响［3－5］，本课题前期应用EST评价T-2毒素为强发育毒性化合物，并得出T-2毒素对ESC的半数抑制浓度为0．57μg·L－1［6］。

ESC在分化过程中，氧耗与供能方式发生改变，即从糖酵解向需氧代谢转换，因此，线粒体的功能对于ESC的分化能力发挥重要作用。已有报道，在ESC自发分化为多种细胞的过程中，发现线粒体DNA的含量和分化的相关性，线粒体DNA数量随着干细胞分化程度的增加而增加，线粒体数目和形态结构发生变化［7－9］；以及过氧化物酶体增殖活化受体γ辅助活化因子1α和活性氧（reactive oxygen species，ROS）对线粒体的调控在ESC向心肌细胞的分化，线粒体功能在多能干细胞和细胞重编程中皆发挥着重要的作用［10－11］。

本研究将通过建立ESC分化模型来作为胚胎毒性测试体外替代模型，从细胞和分子机制来探讨T-2毒素发育毒性作用机制，重点关注T-2毒素在抑制分化作用浓度下对小鼠ESC线粒体功能的影响。

1 材料与方法

1．1 细胞、试剂和主要仪器

小鼠ESC-D3细胞（murine embryonic stem cell，mESC）购自中国科学院上海生物细胞研究所。T-2毒素由军事医学科学院疾病预控制研究所毒理学评价研究中心提供。knockout-DMEM培养基（Du lbecco′s modified Eagle medium）、高糖DMEM、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS），β-巯基乙醇、非必需氨基酸（NEAA）、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES）、L-谷氨酰胺，青链霉素双抗和Trizol均购自德国Invitrogen Gibco公司；四甲基偶氮唑蓝（MTT）、二甲亚砜（DMSO）和明胶购自美国Sigma公司。小鼠白血病抑制因子（murine leukem ia inhibitory factor，m LIF）购自美国Chem icon公司。BCA法蛋白质定量试剂盒购自北京普利来生物公司。2′，7′-二氯荧光素〔2′，7′-dichlorofluorescineiacetate（H2-DCFDA）〕、罗丹明123、ADP、地高辛、苹果酸、谷氨酸均购自美国Sigma公司，ATP合成酶活力试剂盒（PROMEGA ENLITENⓇTotal ATP Rapid Biocontamination Detection Kit）购自美国Promega公司。

1．2 细胞培养及处理

10 mg T-2毒素溶于1 m L DMSO，配成浓度10 g·L－1的母液，每管50μL分装冻存，用时按需用培养基倍比稀释。Tro lox溶解于10 m L超纯水配制成浓度2 mmol·L－1储液，过滤除菌后4℃保存，染毒时用无血清培养基稀释至200μmo l·L－1。

m ESC培养与分化处理按文献描述［6，12］，悬滴3 d、转悬浮2 d生成拟胚体（embroynic body，EB），分别在EB贴壁24，72和120 h后加入T-2毒素，作用浓度为0．5μg·L－1。按照处理时间分组为正常对照组、T-2毒素给药24，72和120 h组。此外，按给药30 m in前Trolox预处理分为单纯Trolox预处理组、Trolox预处理后T-2毒素0．5μg·L－1染毒72 h组。

1．3 透射电子显微镜观察分化m ESC内线粒体结构

收集细胞，锇酸固定，乙醇梯度脱水，环氧丙烷置换，环氧树脂包埋，切片，采用PhilipsEM208s型透射电子显微镜观察，摄片。每组细胞采用3张切片，低倍镜下进行全面细致的观察后8000倍放大倍数下拍照，即在选定的每张切片上随机拍摄细胞内照片各5张。

1．4 线粒体膜电位的测定

收集指数生长期细胞，重悬细胞后，加入罗丹明123染液10 m g·L－1；37℃，5%CO2细胞培养箱孵育30 m in；4℃下800×g离心10 m in，培养基洗细胞2次，PBS重悬；激发波长488～505 nm，发射波长530 nm。以相应荧光探针荧光读数的对数为横坐标，细胞数为纵坐标即可测定m ESC线粒体膜电位的相对强度。

1．5 极谱法［13］测定线粒体呼吸速率

收集细胞，细胞计数，细胞数量为1×105。反应体系3 m L，25℃恒温，以90%速度搅拌。反应介质为（mmol·L－1）：KCl130，HEPES 10，EDTA 1，KH2PO42．5，去脂牛血清蛋白1．5 mg，pH 7．4。加入苹果酸0．1 mmol·L－1和谷氨酸1 mmol·L－1启动态4（ST4）呼吸。平稳后加入200 nmol ADP启ST3呼吸速率。ADP耗尽后重又回到ST4。记录仪记录耗氧曲线，通过曲线测定ST4和ST3呼吸，并计算出呼吸控制比（respiratory control rate，RCR）（ST3／ST4）。

1．6 线粒体ATP合成酶活性的测定

收集细胞，细胞数量为1×105，用线粒体呼吸介质重悬，反应温度为25℃，在0．5 m L反应体系（mmol·L－1）中含有HEPES 10，EDTA 0．5，磷酸缓冲液5，苹果酸6，MgCl22．5，反应温度为25℃，在0．5 m L反应体系中含有（mm o l·L－1）HEPES 10，EDT 0．5，磷酸缓冲液5，苹果酸6，MgCl22．5，记录以上体系的发光强度为本底，加入4μL ADP启动反应，记录发光强度。在不加细胞和ADP的平行实验中，加入ATP 1 nm o l·L－1，记录发光强度，标定ATP合成量。

1．7 统计学分析

2 结果

2．1 T-2毒素对m ESC的线粒体结构的影响

透射电镜显示（图1），正常对照组的m ESC分化后，细胞内线粒体丰富，形态正常，线粒体内可见结构完整的嵴（图1A）；T-2毒素0．5μg·L－1干预后，随时间变化，线粒体数量与质量发生改变，T-2毒素0．5μg·L－1作用24 h线粒体数目未见减少（图1B），而在72与120 h组，可见线粒体数目的明显减少，同时可见线粒体变形，线粒体中少见或缺乏完整的嵴（图1C，D），提示T-2毒素0．5μg·L－1的长期干预会抑制线粒体生成的数量与功能。

2．2 T-2毒素对m ESC线粒体膜电位的影响

结果如图2所示，在T-2毒素作用下，m ESC线粒体膜电位呈时间依赖性下降，表现为膜电位曲线左移（图2A1）。T-2毒素0．5μg·L－1分别作用72和120 h，m ESC线粒体膜电位分别下降23．2%和35．2%（图2A2），差异具有统计学意义（P＜0．05）。Trolox预处理后导致m ESC线粒体膜电位下降减小，膜电位曲线明显右移（图B1和B2），具有统计学意义（P＜0．05）。

Fig．1 Effec t o f T-2 tox in on m itochond ria l u ltrastruc tu re o f m u rine em b ryonic stem cells（m ESCs）by transm ission elec trica lm ic roscope．A：norm al control group；B，C and D：ESCs were treated w ith T-2 0．5μg·L－1for 24，72 and 120 h，respectively．Arrows show m itochondria in differentiated m ESCs．

Fig．2 Effec t o f T-2 tox in on m itochond ria lm em b rane po ten tial（△Ψ）o f m ESCs．A1 and A2：ESCs were treated w ith T-2 0．5μg·L－1for 24，72 and 120 h；B1 and B2：ESCs were pretreated with Trolox 200μmol·L－1for30 m in，then exposed to T-2 toxin 0．5μg·L－1for 72 h．，n＝3．*P＜0．05，compared with normal controlgroup；＃P＜0．05，com pared w ith Trolox group

2．3 T-2毒素对m ESC线粒体呼吸速率的影响

结果如图3所示，T-2毒素对m ESC的RCR有显著影响（图3A）。T-2毒素作用72与120 h，其RCR值分别下降49．5%与55．1%（P＜0．05）（图3B）。经Tro lox预处理后m ESC线粒体呼吸控制比仍明显下降，但与单纯T-2毒素作用比较，mESC中线粒体呼吸控制比显著增加，约增加31%（图3C），差异具有统计学意义（P＜0．05）。

2．4 T-2毒素对mESC线粒体ATP合成酶活性的影响

结果如图4所示，T-2毒素对mESC线粒体的ATP合成酶活性有显著的抑制作用。与对照组相比，各实验组都表现出显著性差异，T-2毒素作用24，72和120 h ATP合成酶活性分别下降25．5%，84．9%和89．3%（图4A）。经Trolox预处理后mESC线粒体合成酶活性仍明显下降，但与单纯T-2毒素作用比较，m ESC中线粒体合成酶活性显著增加，约增加2倍（图4B），差异具有统计学意义（P＜0．05）。

Fig．3 Effect o f T-2 toxin on respiratory contro l ratio（RCR）o fm itochond ria o fm ESCs．A，B：ESCs were treated w ith T-2 0．5μg·L－1for 24，72 and 120 h．C：ESCs were pretreated w ith Trolox 200μmol·L－1for 30 m in，then exposed to T-2 toxin 0．5μg·L－1for 72 h．Dig：digitonin；M＋G：m alage＋glutate．，n＝3．*P＜0．05，com pared w ith normal control group；＃P＜0．05，compared w ith Trolox group．

Fig．4 Effect o f T-2 toxin on ATP synthesis activity o fm ESCs．A：ESCs were treated with T-2 0．5μg·L－1for 24，72 and 120 h．B：ESCs were pretreated with Trolox 200μmol·L－1for30 min，then exposed to T-2 toxin 0．5μg·L－1for72 h．，n＝3．*P＜0．05，compared with normal controlgroup；＃P＜0．05，com pared w ith Trolox group．

3 讨论

ESC分化时有较高的能量要求，分化过程中耗氧与供能方式发生转变，即从糖酵解供能到有氧氧化的转变，线粒体由一种相对较低的活动状态向较高的呼吸功能转化［14－15］。此变化类似于胚胎发育中的线粒体受到体内环境的影响，线粒体的活性和分布状况会随着胚胎发育时期的不同而改变［16－17］。本研究观察到在未分化ESC中线粒体的数目以及嵴都较贫乏，而ESC分化时其发生急剧变化，表现为嵴丰富，数目增加，这与文献报道一致，T-2毒素干预后，ESC内线粒体数目减少，且形态异常，线粒体嵴缺少，提示T-2毒素干预抑制分化的ESC线粒体功能。

Esteban等［18］报道，线粒体膜电位在诱导多能干细胞（induced p luripotent stem ce lls，iPSC）获得多能性的重编程过程中发生了变化。ATP的合成要靠呼吸链不断供给质子以维持一个强大的质子电化学梯度，并经线粒体ATP合成酶的作用将能量转换用于合成ATP，ROS可导致线粒体内膜通透性增加，通透性增加将不能维持质子电化学梯度［13，17］。本研究发现，T-2毒素导致m ESC线粒体功能下降呈时间依赖效应关系，表现为线粒体呼吸速率比下降、膜电位下降及ATP合成酶活性下降。

m ESC分化时需要线粒体功能增加以适应其供能需求与氧耗方式的转变，我们在前期研究中发现T-2毒素可以致分化m ESC内ROS生成增加［6］，推测在长时间的ROS作用下，线粒体呼吸链复合体活力降低，电子传递链功能下降，电子传递受阻，使电子漏增加，电子漏的增加进一步导致自由基的增加，线粒体ROS的生成与清除进一步失衡；过量ROS引发线粒体的自身氧化，线粒体内膜的完整性被破坏，进而引起线粒体膜电位的改变，膜电位的下降又进一步使得ATP生成得到抑制，ATP生成的减少使ESC细胞能量供应降低，进而分化所需能量供给不足，最终表现出抑制ESC的分化，同时也造成线粒体功能降低与氧化损伤的恶性循环。为了进一步证实T-2毒素对m ESC线粒体功能影响的作用机制，本研究选择自由基清除剂Trolox对m ESC进行预处理，结果发现ROS的下降导致线粒体功能在一定程度上得到恢复。由此可见，T-2毒素对线粒体功能的影响与T-2毒素导致ROS的生成有关，其对m ESC线粒体功能的抑制可能是产生发育毒性的作用机制之一。

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T-2 toxin inhibits m itochond rial func tion o f d ifferen tiated m u rine em b ryonic stem cells

FANG Hai-qin1，2，LILi-zhong1，ZHAO Zeng-m ing1，HE Jun1，ZHAO Jun1，YANG Rong1，GENG Xue2，PENG Shuang-qing1
（1．Evaluation and Research Center for Toxicology，Institute of Disease Prevention and Control，Academy o f M ilitary Medica l Sciences，Beijing 100071，China；2．Key Laboratory o f Food Sa fety Risk Assessm ent o f Ministry of Hea lth，China Nationa l Center for Food Safety Risk Assessm ent，Beijing 100021，China）

OBJECTlVE To exp lore the possib le m echanism or action targets of T-2 toxin em bryo toxicity by observing the effect of T-2 toxin on m itochondrial function of differentiated murine embryonic stem cells（m ESCs）．METHODS During differentiation at24，72 and 120 h，ESCs were exposed to T-2 toxin 0．5μg·L－1．Meanwhile，m ESCs were pre-treated with antioxidant Trolox（200μmol·L－1）for 30 m in and exposed to T-2 toxin（0．5μg·L－1）for 72 h．The m itochondrial ultrasture of differentiated m ESCs was observed under a transim ission electricalm icroscope（TEM）．The differentiated ESC m itochond ria l function，inc luding respiratory contro l ratio（RCR），ATP synthase activity and m itochondria l m embrane potentia l（MMP），was measured at 144 h a fter differentiation．RESULTS Significant decrease of the m itochondria lnumber，de formation o fm itochond ria lstructure，and lack o f comp lete m itochod rial crestwere observed through TEM in the groups o f T-2 toxin exposed for 72 and 120 h，respectively．Compared with the normal control group，RCR declined by 49．5%and 55．1%，ATP synthase activity decreased by 84．9%and 89．3%，and MMP decreased by 23．2%and 35．2%in T-2 toxin 0．5μg·L－1exposure 72 and 120 h group，respectively．However，the inhibition ofm itochondrial function by T-2 toxin in differentiated m ESCs recovered significantly in the presence of the antioxidant Trolox．CONCLUSlON T-2 toxin induces oxidative stress and inhibitsm ESCsm itochondrial function in differentiated m ESCs，and ROS-induced m itochondria lm a lfunction p lays an im portant ro le in T-2 toxin em bryonic toxicity m echanism．

T-2 toxin；toxic actions；embryonic stem ce lls；m itochond ria l；ce ll differentiation

PENG Shuang-qing，E-mail：pengsq＠hotmail．com，Tel：（010）66948462

R394．1

A

1000-3002（2014）03-0415-06

Foundation item：The project supported by International Cooperation Project from Ministry of Science and Technology of China（2011DFA32190）；National Natural Science Founda tion of China（81172699）；National Natural Science Foundation of China（81302462）；and Natural Science Foundation of Beijing City（7142128）

2014-01-02 接受日期：2014-05-10）

（本文编辑：乔 虹）

国家科技部国际合作项目（2011DFA32190）；国家自然科学基金项目（81172699）；国家自然科学基金项目（81302462）；北京市自然科学基金资助项目（7142128）

方海琴（1977－），女，博士，助理研究员，主要从事食品毒理学研究；彭双清（1962－），男，博士，研究员，博士生导师，主要从事化学物安全性评价研究。

彭双清，E-mail：pengsq＠hotm ail．com，Tel：（010）66948462