Apo-2L对放射线诱导鼻咽癌CNE细胞凋亡作用

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(青岛大学附属医院肿瘤科，山东 青岛 266003)

凋亡素2配体(Apo-2L)又被称为肿瘤坏死因子相关凋亡诱导抗体(TRAIL)，属于肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员之一[1]。研究表明，Apo-2L广泛表达于多种组织，通过与细胞膜上的死亡受体结合选择性诱导肿瘤细胞凋亡，但对正常细胞无明显的毒性作用[2]，成为目前肿瘤生物治疗新的研究方向[1]。但是并非所有肿瘤细胞对Apo-2L都敏感，有研究显示，约有60%肿瘤细胞对其敏感[3]。另有研究表明，Apo-2L与放化疗具有协同作用[4]。本文研究Apo-2L与放射治疗协同对体外培养鼻咽癌CNE细胞增殖周期及凋亡率的影响，以期为临床应用提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

CNE细胞株购自上海复祥科技有限公司;重组人Apo-2L购自江莱试剂(上海)有限公司;MTT试剂盒及细胞凋亡检测试剂盒均购自美国Sigma公司;RPMI-1640培养液、胎牛血清、2.5 g/L胰蛋白酶购自Hyclon公司;青链霉素混合液、冻存液购自Solarbio公司;二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司;常温离心机由上海医用仪器厂生产;光学显微镜、倒置显微镜为日本Olympus公司生产;吸收光酶标仪(ELx808)为美国Biotek公司生产;流式细胞仪为美国贝克曼库尔特公司生产;医用直线加速器(23EX)为美国Varian公司生产。

1.2 研究方法

1.2.1细胞培养 CNE细胞用RPMI-1640培养液(含体积分数0.10新生牛血清)，在含体积分数0.05的CO2、37 ℃培养箱中常规培养，至细胞融合达70%时进行传代，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2体外细胞增殖抑制实验 选取对数生长期的CNE细胞，加入2.5 g/L胰酶消化30 s，加入含血清RPMI-1640液3 mL终止消化，并充分吹打细胞，吹打混匀后，取100 μL进行细胞计数，根据计数结果，配制密度为1×107/L细胞悬液，接种于平底96孔板， 加入RPMI-1640液梯度稀释的Apo-2L，最终浓度分别为10、50、100、200、400、800 μg/L。每组设5个复孔，并设调零孔和对照孔，置培养箱内分别培养24、48 h，加入5 g/L的 MTT 20 μL，作用4 h后看到蓝色结晶时，弃去上清液，加入DMSO 150 μL，轻微震荡后用酶标仪检测492 nm波长处吸光度(A)值，计算细胞抑制率。参考细胞生长抑制≤50%的实验药物浓度(IC50)，选择Apo-2L的最佳实验药物浓度。

1.2.3实验分组及处理方法 取对数生长期CNE细胞，调整细胞密度为5×107/L，接种于12.5 mm2培养瓶中预培养24 h至对数生长期，随机分为对照组(CK组)、Apo-2L组(T组)、Apo-2L+放射组(T+R组)及单纯放射组(R组)。培养细胞至对数生长期后，T组及T+R组加入最佳实验药物浓度的Apo-2L[5]，对照组及R组加入等量培养液，作用12 h后，T+R组及R组行6 MV X线照射(DT=2.0 Gy，SSD=100 cm，FSZ=10 cm×10 cm，1 cm厚组织补偿和反散射胶体[6])，其余两组只给予摆位而不进行照射，照射完毕继续培养累计24 h。

1.2.4流式细胞仪检测细胞凋亡 根据凋亡检测试剂盒方法，收集累计作用24 h的CNE细胞，Annexin V-FITC和 PI染色，避光、常温孵育15 min后于1 h内上流式细胞仪检测细胞凋亡率。根据细胞周期检测试剂盒步骤进行细胞周期分析。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 不同浓度Apo-2L对CNE细胞增殖的影响

不同浓度Apo-2L作用鼻咽癌CNE细胞24、48 h，鼻咽癌CNE细胞抑制率随着Apo-2L浓度升高而升高，差异有显著性(F=11.35,P<0.05)，鼻咽癌CNE细胞的抑制率与Apo-2L的浓度呈正相关(r=0.91,P<0.05)。见表1、图1。根据不同浓度Apo-2L对鼻咽癌CNE细胞抑制率曲线和IC50计算，并参考MARINI等[5]的方法，实验最终选择100 μg/L的Apo-2L作用24 h为凋亡率实验浓度和作用时间。

2.2 各组细胞凋亡率的比较

流式细胞仪检测显示，CK组、T组、R组、R+T组细胞凋亡率分别为4.027±0.357、6.503±0.517、8.637±0.279、11.213±0.472。各组细胞凋亡率比较，R组、T组高于CK组，R+T组高于R组、T组，差异有显著性(F=8.64，P<0.05)。见图2。

表1 不同浓度Apo-2L分别作用24、48 h鼻咽癌CNE细胞抑制率

图1 不同浓度Apo-2L作用24、48 h的鼻咽癌CNE细胞抑制率对数曲线

图2 各组鼻咽癌CNE细胞培养24 h凋亡情况

2.3 各组细胞周期分布比较

CK组和R+T组G0-G1期细胞比率高于其他两组，差异有显著性(F=16.23,P<0.05)；S期各组间比较差异无显著性(P>0.05)；R+T组G2-M期细胞比率较其他各组降低，差异有显著意义(F=7.74,P<0.05)；其余各组各期细胞分布差异无显著性(P>0.05)。见表2。

表2 各组细胞周期分布比较

3 讨 论

鼻咽癌主要发生于黄种人，亚洲及南太平洋国家和地区多发，也是我国最常见的恶性肿瘤之一。 近年来研究认为，EB病毒与鼻咽癌的关系密切。病理检查显示，鼻咽癌多为低分化鳞癌，因靶区深在而广泛，手术的毁损性大，公认的首选治疗方法为放射治疗，但仅早期病人的治疗效果满意；化学治疗对疗效提高起到一定作用，中医中药及免疫治疗等对疗效的提高作用有限。

Apo-2L广泛表达于多种人体正常组织，通过与细胞膜上的死亡受体结合选择性诱导肿瘤细胞凋亡，但对正常细胞无明显毒性作用[2]；有研究结果表明，Apo-2L与放化疗具有协同作用[4]。目前，已发现5种特异性Apo-2L受体，即死亡受体(DR)中的DR4(TRAIL-1)、DR5(TRAIL-2)，诱骗受体(DcR)中的DcR1(TRAIL-3)、DcR2(TRAIL-4)，以及抑骨素(OPG)。DR4、DR5与Apo-2L受体特异性结合后，通过激活Caspase蛋白酶解级联反应，导致细胞凋亡；DcR1、DcR2与Apo-2L结合后不能转导凋亡信号，但可与DR4、DR5竞争结合Apo-2L受体，从而抑制Apo-2L介导的细胞凋亡。Apo-2L受体在人体正常细胞与肿瘤细胞中存在表达特异性，正常细胞常同时表达DR和DcR，而肿瘤细胞中DcR常不表达，这一差异可能是Apo-2L能够选择性杀伤肿瘤细胞的原因[7]。

Apo-2L诱导细胞凋亡作用是通过与细胞膜上的DR4、DR5结合后启动的，通过FADD途径激活Caspase从而启动线粒体依赖和线粒体非依赖两种途径诱导细胞发生凋亡。另外，Apo-2L还可以通过TRADD途径激活核转录因子(NF-κB)来调节细胞凋亡。目前研究认为，NF-κB主要参与拮抗Apo-2L的凋亡作用[8]。尽管Apo-2L能够选择性诱导肿瘤细胞凋亡，但也面临耐药问题，其耐药机制可能与细胞内多种促凋亡因子和抗凋亡因子作用有关，几乎涉及凋亡信号转导各个途径。但是并非所有肿瘤细胞对Apo-2L都敏感，有研究显示，约有60%肿瘤细胞对其敏感[3]。本文的研究结果表明，Apo-2L能提高鼻咽癌CNE细胞凋亡率，而且与剂量正相关；IC50计算结果显示，浓度100 μg/L的Apo-2L为鼻咽癌CNE细胞的最佳作用浓度；细胞凋亡检测显示， 100 μg/L的Apo-2L作用24 h后R+T组凋亡率高于CK组、T组、R组，差异有显著性；R+T组G2-M期细胞比率低于其他3组，差异有显著性。说明体外放疗联合Apo-2L能够作用于鼻咽癌CNE细胞周期，促进细胞周期同步化分布，对分次放疗有潜协同作用。

放射治疗可通过直接或间接引起DNA损伤，激活一系列基因、因子或蛋白最终引起细胞凋亡[9]。有研究显示，放射线能够增强肿瘤细胞对Apo-2L的敏感性，二者具有交叉增敏作用[10]。其机制可能为：①通过上调死亡受体DR4、DR5的表达，增加肿瘤细胞对Apo-2L敏感性[10]；②通过影响细胞内Bax表达从而调节线粒体依赖的细胞凋亡；③通过增强Caspase瀑布式级联放大反应而引起细胞凋亡[11]，这种协同作用是P53依赖性的[5]。

在鼻咽癌治疗中，放射治疗的效果与放射线剂量呈正相关，由于放射野内要害器官的限制，使得放射治疗的照射剂量受限，中、晚期病人往往很难达到满意疗效。Apo-2L对肿瘤细胞有特异性的凋亡诱导作用，理论上与放射线协同可能增强鼻咽癌细胞凋亡，加速细胞周期同步化，与分次放疗相配合，促进肿瘤细胞杀伤和缩小靶区体积。如果加大肿瘤细胞杀灭同时，适度降低放射剂量，可以减少射野内要害器官的照射损伤，对正常组织起到保护作用。

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