两种不同形态猪苓菌核液体发酵生产胞外多糖的分析

党小利+陈文强+彭浩+邓百万+解修超

摘要：对2种不同形态猪苓（Polyporus umbellatus）菌核液体发酵生产胞外多糖进行了研究。结果表明，猪苓菌核液体发酵生产胞外多糖的发酵条件是温度28 ℃，pH 4.8～5.5， 振荡速度110 r/min，通气量4 L/min，罐压0.090 0 MPa，发酵7 d，每12 h取样测其胞外多糖的含量，在72 h和60 h时猪苓（FrCM2）和猪苓（FrCM3）液体发酵产胞外多糖的含量分别为1.783和0.044 mg/mL，猪苓（FrCM2）液体发酵产胞外多糖含量明显高于猪苓（FrCM3）。

关键词：猪苓（Polyporus umbellatus）；液体发酵；胞外多糖

中图分类号：S567.3；R282.7 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）01-0171-04

Exopolysaccharide Production by Liquid Fermentation of Two Polyporus umbellatus

DANG Xiao-li1，CHEN Wen-qiang2，PENG Hao2，DENG Bai-wan2，XIE Xiu-chao2

（1.Weinan Vocational Technical College， Weinan 714000， Shaanxi， China； 2. School of Biological Science and Engineering， Shaanxi University of Technology/Shaanxi Engineering Research Center of Edible and Medicated Fungi， Hanzhong 723001， Shaanxi， China）

Abstract： The exopolysaccharide of two Polyporus umbellatus by liquid fermentation was analyzed. The results showed when fermented 7 d under 28 ℃ and pH 4.8～5.5 with rotational speed 110 r/min， ventilation quantity 4 L/min and pot press 0.0900 MPa， the exopolysaccharide content of P. umbellatus（FrCM2） and P. umbellatus（FrCM3） reached peak at 72 h and 60 h， and the contents were o 1.783 mg/mL and 0.044 mg/mL respectively. It indicated that the contents of exopolysaccharide of P.umbellatus（FrCM2） were significantly higher than that of P.s umbellatus（FrCM3）.

Key words： Polyporus umbellatus； liquid fermentation； exopolysaccharide

收稿日期：2013-05-10

作者简介：党小利（1979-），女，陕西澄城人，副教授，主要从事微生物学教学和研究工作，（电话）15129849122（电子信箱）dangwangyan@sohu.com；

通讯作者，陈文强（1956-），男，陕西洋县人，教授，硕士生导师，主要从事微生物资源保护与开发利用研究，（电子信箱）

wenqiangc@126.com。

猪苓（Polypro umbelletus）是一种重要的药用真菌，属担子菌门担子菌纲多孔菌目（非褶菌目）多孔菌科猪苓属，别名猪茯苓、猪屎苓、地乌桃。其菌核体的大小和形状与生姜的根茎相似[1]，呈长形块状或不规则块状，半木质化，稍扁，表面灰黑或黑色，凹凸不平。子实体从埋生于地下的菌核内生出，多数合生，菌柄往往于基部相连或大量分枝，形成一丛菌盖[2]，菌盖圆形，中部下凹进呈浅漏斗形，边缘内卷，总直径达到15 cm以上，俗称“猪苓花”，可食用且味道鲜美。中国野生猪苓主要分布在河北、河南、安徽、浙江、福建、湖南、湖北、四川、贵州、云南、山西、陕西、甘肃、青海、内蒙古及东北等地。

近年来，国内外研究发现猪苓中含水溶性多聚糖化合物、猪苓聚糖（Gu-1）、麦角甾醇（Ergostol，C28H44O）、α-羟基-廿四碳酸（α-Hydroxy-tetracosanoic acid，C24H48O3）、生物素（维生素H、Biotin）、粗蛋白等，具有广阔的开发价值和应用前景。多糖是由许多单糖分子以糖苷键结合而成的天然高分子化合物，是生命有机体的重要组成部分，广泛存在于各种生物体组织中，根据功能不同可分为结构多糖和活性多糖。活性多糖又有纯多糖和杂多糖之分，活性多糖专指具有某种特殊生物活性的多糖化合物，如真菌多糖、植物多糖和壳聚糖等。这些多糖具有复杂的多方面的生理活性和功能，如具有免疫调节功能、抗肿瘤作用、延缓衰老作用、降血脂抗血栓作用等功能，因而越来越引起人们的关注[3]。真菌多糖是从食药用真菌子实体、菌丝体和发酵液中分离出的代谢产物，在国际上被称为“生物反应调节剂”（简称BRM）[4]，是食药用真菌中具有生物活性的有效组分之一，且来源于食药用真菌多糖的部分产品已进入临床试验，用于癌症等疾病的免疫治疗[5]。

20世纪70年代，日本学者首次从猪苓菌核中提取而成具有显著生理活性的一类物质—猪苓多糖[6-8]，猪苓多糖是存在于猪苓的菌丝体和子实体中的水溶性多糖，中医临床上常用于治疗急性肾炎、全身浮肿、小便不畅、尿急尿频、尿道疼痛、受暑水泻以及急性肝炎、急性胃炎等疾病。近年来的研究表明，从野生猪苓中提取的猪苓多糖是一种非特异性细胞免疫刺激剂，能显著地增强网状内皮系统吞噬细胞的功能，使癌细胞生长受到抑制，具有明显的抗肿瘤作用，临床上用于肺癌、白血病、肝癌等放射治疗（放疗）和化学药物治疗（化疗）的辅助治疗，可提高患者的抗病能力，这引起了医学界对猪苓研究的重视。研究证明，从液体培养的猪苓菌丝体和发酵液中提取的猪苓多糖与从野生猪苓菌核提取的猪苓多糖一样具有抗肿瘤作用[9]。猪苓胞外多糖液体发酵法可以不受季节限制进行工业化连续生产，其规模大、产量高、发酵周期短、生产成本低，具有广阔的发展前景[9，10]。

在猪苓液体发酵过程中除菌丝或孢子大量增殖外，还会产生多糖、多肽、生物碱、萜类化合物及甾醇、酶、核酸、氨基酸、维生素、植物激素等多种具有生理活性的物质，具有抗癌、抗炎、抗菌、抗衰老、抗溃疡等功效[11]。虽然从子实体中也可获得这些物质，但无论从生产规模、生产周期及经济效益等方面均不及用液体发酵来获取[12，13]。因此，以猪苓深层液体发酵生产猪苓胞外多糖为目的产物，可以简化生产工艺、降低成本、提高生产效率。

目前有关猪苓液体发酵生产胞外多糖的研究报道较少，本研究对秦巴山区2种不同形态猪苓菌核（当地俗名鸡屎苓、铁蛋猪屎苓）液体发酵生产胞外多糖进行了分析，旨在为工业化生产猪苓胞外多糖提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种 猪苓由陕西省食药用菌工程技术研究中心提供。分两种：一种为分枝少呈长形块状，表面较光滑，俗称猪屎苓 （FrCM2）；一种呈不规则球形，俗称铁蛋猪屎苓（FrCM3）。

1.1.2 培养基 PDA培养基（马铃薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，KH2PO4 5.0 g，MgSO4·7H2O 3.0 g，维生素B1 0.1 g，琼脂18.0 g，pH自然）；液体种子培养基（玉米粉30.0 g，酵母膏 30.0 g，KH2PO4 1.0 g，MgSO4·7H2O 1.0 g，CaCO3 1.0 g，维生素B1 0.1 g，pH 5.4～5.8）；液体发酵培养基（土豆100.0 g，KH2PO4 5.0 g，MgSO4·7H2O 2.5 g，维生素B1 0.01 g，玉米粉10.0 g，豆饼粉 2.0 g，pH 4.5～5.8）。

1.1.3 试剂 5%苯酚溶液（放置在棕色试剂瓶中冷藏于冰箱），98%H2SO4，0.1 mg/mL的标准葡萄糖溶液。

1.1.4 主要仪器与设备 BIOTECH-7BGZ型在位灭菌发酵罐（上海保兴生物设备工程有限公司），722型分光光度仪（上海光谱仪器有限公司），GTR25-1型高速冷冻离心机（江苏南通理能实验器材有限公司），HZ2014A型恒温培养箱（上海智诚分析仪器制造有限公司），ZHWY-210 2C型摇床（上海志成公司），BHC-1300IIA2型超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司），FA1604型电子天平（上海精科天美科学仪器有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化 配制PDA培养基，分装试管，121.3 ℃灭菌30 min，摆斜面。接种，在25～28 ℃恒温箱中培养，待菌丝满管后置4 ℃冰箱保藏备用。

1.2.2 一级种制备 配制液体种子培养基，分装于100 mL三角瓶中，装液量30 mL，121.3 ℃灭菌30 min，冷却后接0.5～1.0 cm2活化的菌块，160 r/min振荡，28 ℃恒温培养10～15 d。

1.2.3 二级种制备 配制液体种子培养基，分装于1 000 mL三角瓶中，装液量为500 mL，121.3 ℃灭菌30 min，冷却后接一级液体种，接种量为10%，160 r/min振荡，28 ℃恒温培养10～15 d。

1.2.4 液体发酵 配制5 000 mL液体发酵培养基装入发酵罐中，加入0.1%的植物油作为消泡剂，121.3 ℃灭菌30 min，冷却后接猪苓二级液体种，接种量为10%。在通气量4 L/min，振荡速度110 r/min，pH 4.8～5.5，28 ℃条件下进行液体发酵，发酵时间为7 d。

1.2.5 猪苓菌核胞外多糖含量的测定 5%苯酚溶液的制备：精确称量苯酚晶体5.0 g，加去离子水溶解并定容至100 mL，混匀后再转入棕色试剂瓶，超声波处理30 min后置于冰箱中保存备用。绘制葡萄糖标准曲线：精确称取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖标准品100.0 mg于100 mL容量瓶中，定容至100 mL，混匀后取10 mL于另一个100 mL的容量瓶中，定容至100 mL，制成0.1 mg/mL的对照品溶液，分别稀释至5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 μg/mL 6种浓度。吸取不同浓度对照品溶液各1.0 mL置于试管中，加5%的苯酚溶液1.5 mL，混匀后迅速加入7.5 mL的98% H2SO4，用纯水作空白对照，摇匀后40 ℃水浴30 min，冰浴5 min，在490 nm处用分光光度计测定其吸光度，以葡萄糖浓度（μg/mL）为横坐标x，吸光度为纵坐标y，经计算得回归方程：y=0.022 7x-0.032 0，R2=0.998 6。绘制葡萄糖标准曲线（图1）。结果表明，葡萄糖浓度在10～50 μg/mL浓度范围内与吸光度呈良好的线性关系。

猪苓菌核胞外多糖检测：将50 mL猪苓菌核发酵液 6 000 r/min离心20 min[14]，取离心后的上清液0.2 mL于100 mL的容量瓶中，定容至100 mL，摇匀后吸取1.0 mL于试管中，加入5%苯酚1.5 mL摇匀，再迅速加入98%H2SO4 7.5 mL，40 ℃水浴放置30 min，冰浴5 min，在490 nm下测定其吸光度。根据标准曲线和回归方程计算其多糖含量。

2 结果与分析

2.1 2种不同形态猪苓菌核（FrCM2、FrCM3）液体发酵产胞外多糖的结果

在发酵温度为28 ℃，通气量4 L/min，接种量10%，振荡速度110 r/min， pH 4.8～5.5条件下发酵7 d。发酵过程中每12 h取样50 mL，6 000 r/min离心20 min，取上清液，测定2种不同形态猪苓菌核（FrCM2、FrCM3）液体发酵产生的胞外多糖，结果见图2、图3。

由图2可见， 不同发酵时间对猪苓（FrCM2）液体发酵产胞外多糖的含量有明显影响。在培养12 h后，猪苓菌丝体产生的胞外多糖含量呈缓慢增加趋势，48 h时猪苓胞外多糖的含量开始明显增加。表明猪苓菌丝细胞处于对数生长期，菌丝体生成速度加快，pH相对比较稳定，此时胞外多糖大量合成，在72 h时达到最大值1.783 mg/mL。之后由于发酵后期底物浓度大大降低，加之在代谢产物抑制等因素的影响下，猪苓菌丝体已不能维持正常的生长代谢，细胞大量死亡自溶，且分泌产生的胞外多糖可能又被自身利用，因此猪苓（FrCM2）胞外多糖的含量逐渐下降。

由图3可见，不同发酵时间对猪苓（FrCM3）液体发酵产胞外多糖的含量亦有较明显影响。在发酵60 h时猪苓胞外多糖含量达到峰值，之后随培养时间的延长猪苓胞外多糖含量随之降低，此变化曲线与微生物生长的规律相一致。在发酵开始时猪苓胞外多糖含量无明显的变化，48 h后呈增加趋势，此时猪苓菌丝体逐渐进入对数生长期，生长速度加快，至60 h时其胞外多糖含量增至最高值，达0.044 mg/mL；之后猪苓胞外多糖含量开始缓慢降低，此时猪苓菌丝生长速度减慢，再加之营养物质消耗和代谢产物积累，在发酵120 h后，猪苓菌丝体已不能维持正常的生长代谢，细胞大量死亡自溶，因此猪苓（FrCM3）胞外多糖的含量逐渐下降。

2.2 2种猪苓菌核液体发酵生产胞外多糖的比较分析

图2和图3结果表明，2种不同形态猪苓菌核液体发酵生产胞外多糖在发酵的不同时期，胞外多糖含量差异较大。猪苓（FrCM2）发酵液中胞外多糖含量高于猪苓（FrCM3）发酵液中胞外多糖的含量。发酵72 h时，猪苓（FrCM2）发酵液中胞外多糖含量达到峰值1.783 mg/mL，发酵60 h时，猪苓（FrCM3）发酵液中胞外多糖含量达峰值0.044 mg/mL。猪苓（FrCM2）液体发酵产胞外多糖含量明显高于猪苓（FrCM3）。

3 小结与讨论

1）本试验在相同条件下对2种不同形态猪苓菌核进行了液体发酵生产胞外多糖的研究，在发酵72 h时猪苓（FrCM2）发酵液中胞外多糖含量达到1.783 mg/mL，在发酵60 h猪苓（FrCM3）发酵液中胞外多糖含量达到0.044 mg/mL。猪苓（FrCM2）和（FrCM3）液体发酵所产生的胞外多糖含量差异较大，原因可能是这2种猪苓属不同的物种，但要确定猪苓（FrCM2）和（FrCM3）是否属于不同物种尚有待进一步研究。

2）本试验采用苯酚-硫酸法测定发酵液中猪苓胞外多糖的含量，此法具有稳定性和重现性好等优点，在测定胞外多糖含量过程中被广泛采用。

3）液体发酵宜采用二级菌种接种。这样可避免杂菌污染，有利于菌种成活。

4）猪苓液体发酵培养基中含有玉米粉，在测定发酵液中胞外多糖含量时，有些可溶性的淀粉和其他多糖会混合其中，影响其测定结果的准确性。尚需对猪苓液体发酵液中胞外多糖的检测标准进行进一步研究。

参考文献：

[1] 陈文强，邓百万，彭 浩，等.药用真菌猪苓的研究现状及应用展望[J].中国食用菌，2012，31（1）：1-4.

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（责任编辑 曾德芳）

由图3可见，不同发酵时间对猪苓（FrCM3）液体发酵产胞外多糖的含量亦有较明显影响。在发酵60 h时猪苓胞外多糖含量达到峰值，之后随培养时间的延长猪苓胞外多糖含量随之降低，此变化曲线与微生物生长的规律相一致。在发酵开始时猪苓胞外多糖含量无明显的变化，48 h后呈增加趋势，此时猪苓菌丝体逐渐进入对数生长期，生长速度加快，至60 h时其胞外多糖含量增至最高值，达0.044 mg/mL；之后猪苓胞外多糖含量开始缓慢降低，此时猪苓菌丝生长速度减慢，再加之营养物质消耗和代谢产物积累，在发酵120 h后，猪苓菌丝体已不能维持正常的生长代谢，细胞大量死亡自溶，因此猪苓（FrCM3）胞外多糖的含量逐渐下降。

2.2 2种猪苓菌核液体发酵生产胞外多糖的比较分析

图2和图3结果表明，2种不同形态猪苓菌核液体发酵生产胞外多糖在发酵的不同时期，胞外多糖含量差异较大。猪苓（FrCM2）发酵液中胞外多糖含量高于猪苓（FrCM3）发酵液中胞外多糖的含量。发酵72 h时，猪苓（FrCM2）发酵液中胞外多糖含量达到峰值1.783 mg/mL，发酵60 h时，猪苓（FrCM3）发酵液中胞外多糖含量达峰值0.044 mg/mL。猪苓（FrCM2）液体发酵产胞外多糖含量明显高于猪苓（FrCM3）。

3 小结与讨论

1）本试验在相同条件下对2种不同形态猪苓菌核进行了液体发酵生产胞外多糖的研究，在发酵72 h时猪苓（FrCM2）发酵液中胞外多糖含量达到1.783 mg/mL，在发酵60 h猪苓（FrCM3）发酵液中胞外多糖含量达到0.044 mg/mL。猪苓（FrCM2）和（FrCM3）液体发酵所产生的胞外多糖含量差异较大，原因可能是这2种猪苓属不同的物种，但要确定猪苓（FrCM2）和（FrCM3）是否属于不同物种尚有待进一步研究。

2）本试验采用苯酚-硫酸法测定发酵液中猪苓胞外多糖的含量，此法具有稳定性和重现性好等优点，在测定胞外多糖含量过程中被广泛采用。

3）液体发酵宜采用二级菌种接种。这样可避免杂菌污染，有利于菌种成活。

4）猪苓液体发酵培养基中含有玉米粉，在测定发酵液中胞外多糖含量时，有些可溶性的淀粉和其他多糖会混合其中，影响其测定结果的准确性。尚需对猪苓液体发酵液中胞外多糖的检测标准进行进一步研究。

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[13] 李 羿，万德光，杨 胜.茯苓发酵液中多糖的提取分离[J].化学研究与应用，2006，18（9）：1099-1101.

[14] YUAN D， MORI J， KOMATSU K I，et al. An anti-aldosteronic diuretic component（drain dampness）in Polyporus Sclerotium[J]. Biol Pharm Bull，2004，27（6）：867-870.

（责任编辑 曾德芳）

由图3可见，不同发酵时间对猪苓（FrCM3）液体发酵产胞外多糖的含量亦有较明显影响。在发酵60 h时猪苓胞外多糖含量达到峰值，之后随培养时间的延长猪苓胞外多糖含量随之降低，此变化曲线与微生物生长的规律相一致。在发酵开始时猪苓胞外多糖含量无明显的变化，48 h后呈增加趋势，此时猪苓菌丝体逐渐进入对数生长期，生长速度加快，至60 h时其胞外多糖含量增至最高值，达0.044 mg/mL；之后猪苓胞外多糖含量开始缓慢降低，此时猪苓菌丝生长速度减慢，再加之营养物质消耗和代谢产物积累，在发酵120 h后，猪苓菌丝体已不能维持正常的生长代谢，细胞大量死亡自溶，因此猪苓（FrCM3）胞外多糖的含量逐渐下降。

2.2 2种猪苓菌核液体发酵生产胞外多糖的比较分析

图2和图3结果表明，2种不同形态猪苓菌核液体发酵生产胞外多糖在发酵的不同时期，胞外多糖含量差异较大。猪苓（FrCM2）发酵液中胞外多糖含量高于猪苓（FrCM3）发酵液中胞外多糖的含量。发酵72 h时，猪苓（FrCM2）发酵液中胞外多糖含量达到峰值1.783 mg/mL，发酵60 h时，猪苓（FrCM3）发酵液中胞外多糖含量达峰值0.044 mg/mL。猪苓（FrCM2）液体发酵产胞外多糖含量明显高于猪苓（FrCM3）。

3 小结与讨论

1）本试验在相同条件下对2种不同形态猪苓菌核进行了液体发酵生产胞外多糖的研究，在发酵72 h时猪苓（FrCM2）发酵液中胞外多糖含量达到1.783 mg/mL，在发酵60 h猪苓（FrCM3）发酵液中胞外多糖含量达到0.044 mg/mL。猪苓（FrCM2）和（FrCM3）液体发酵所产生的胞外多糖含量差异较大，原因可能是这2种猪苓属不同的物种，但要确定猪苓（FrCM2）和（FrCM3）是否属于不同物种尚有待进一步研究。

2）本试验采用苯酚-硫酸法测定发酵液中猪苓胞外多糖的含量，此法具有稳定性和重现性好等优点，在测定胞外多糖含量过程中被广泛采用。

3）液体发酵宜采用二级菌种接种。这样可避免杂菌污染，有利于菌种成活。

4）猪苓液体发酵培养基中含有玉米粉，在测定发酵液中胞外多糖含量时，有些可溶性的淀粉和其他多糖会混合其中，影响其测定结果的准确性。尚需对猪苓液体发酵液中胞外多糖的检测标准进行进一步研究。

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（责任编辑 曾德芳）