猪苓及猪苓多糖对BBN联合糖精作用Fisher-344大鼠肝脏代谢酶的影响

张国伟，李彩霞，王艳峰，黄 羽，苏芝军，郑 芳，曾 星*

1河北大学中医学院，保定071002;2广州中医药大学第二临床医学院，广州510006; 3中国医药集团四川抗菌素工业研究所，成都610051;4陕西省府谷县人民医院，府谷719400

猪苓及猪苓多糖对BBN联合糖精作用Fisher-344大鼠肝脏代谢酶的影响

张国伟1，李彩霞2，王艳峰3，黄 羽2，苏芝军4，郑 芳2，曾 星2*

1河北大学中医学院，保定071002;2广州中医药大学第二临床医学院，广州510006;3中国医药集团四川抗菌素工业研究所，成都610051;4陕西省府谷县人民医院，府谷719400

以BBN联合糖精作用Fisher-344大鼠，分别使用ELISA及RT-PCR方法测定样本中CYP450、GST和NQO1酶活性及Gstpi和NQO1 mRNA相对表达含量。结果表明，猪苓及猪苓多糖均可使样本中CYP450酶活性显著降低，其中猪苓对CYP450酶活性抑制呈剂量依赖性;猪苓及猪苓多糖对样本中GST无明显影响，猪苓可显著升高样本中NQO1酶活性;猪苓高剂量及猪苓多糖可上调GSTPi mRNA表达，猪苓及猪苓多糖对NQO1 mRNA表达无明显作用。研究表明猪苓及猪苓多糖抗癌作用与降低CYP450与升高NQO1酶活性有关，但机制有待进一步研究。

猪苓;猪苓多糖;细胞色素P450;Ⅱ相代谢酶

猪苓及猪苓多糖对N-丁基-N-(4-羟丁基)亚硝胺(BBN，N-butyl-N-(4-hydroxy--butyl)-nitrosamine)联合糖精(Saccharin)诱导大鼠膀胱癌具有显著的预防作用，其预防作用与上调实验鼠膀胱组织中Ⅱ相酶谷胱甘肽转移酶-π(GSTPi，glutathione S-transferase-π)和NADP(H)醌氧化还原酶(NQO1，NAD(P) H:quinone oxidoreductase 1)有关［1］。本文研究猪苓及猪苓多糖对BBN联合糖精作用大鼠肝脏中代谢酶细胞色素P450(CYP450，cytochrome P450)、谷胱甘肽转移酶(GST，glutathione S-transferase)、NQO1活性及GSTPi、NQO1mRNA表达作用。

1 材料、试剂与仪器

猪苓，江阴天江药业有限公司，每克相当于10克生药，用前按剂量溶于生理盐水;猪苓多糖，广东华南药业集团有限公司，用前按剂量溶于生理盐水; BBN，日本TCI株式会社;糖精，上海第六制药厂。Trizol，Invitrogen，Carlsbad，CA;PrimescriptTM RT reagent，SYBP Premix Ex TaqTM，TAKARA;氯仿、异丙醇及无水乙醇均为新开瓶分析纯。

PCR仪，ABI 7500 Real Time PCR System;UV-4000紫外可见分光光度计，Pharmacia Biotech公司;电泳仪，BIO-RAD;BIO-RAD Gel Dox XR凝胶成相系统。

2 实验动物及分组

雌性Fisher-344大鼠60只，7周龄，购于北京维通利华实验动物有限公司，实验开始前实验动物前于实验环境中适应3 d。实验动物给予含0.05% BBN饮用水阶段于广东医学实验动物中心进行，给予供试物阶段于广东省中医药科学院动物房进行。动物实验遵守广东省中医院实验动物伦理规范，动物饲养环境，温度为23±2℃，湿度为55±5%，12 h/12 h白昼交替，自由饮水，标准饲养饲料。

图1 实验动物分组及造模示意图Fig.1 Experimental animal groups and bladder cancer model establishment

将大鼠随机分为6组，每组10只，即生理盐水组，模型组，猪苓多糖组(130 mg/kg)，猪苓50 mg/ kg组，猪苓250 mg/kg组和猪苓500 mg/kg组。除生理盐水组外，其它5组实验大鼠从实验开始到第8周给予含0.05%BBN的饮用水;第8周后，实验大鼠开始给予含5%糖精的饮用水，至第20周截止;从第9周开始给予猪苓及猪苓多糖供试物，剂量为1 ml/100 g，给药至实验结束为止［图1］。实验结束后，所取肝脏组织于-80℃冻存。

3 方法

3.1 CYP450、GST和NQO1酶活性测定

3.1.1 肝脏样本的制备

切取并称量大鼠肝脏约100 mg，加入一定量4℃预冷PBS中，电动匀浆器6000～8000 r/min匀浆30 s，制备成5%匀浆液，10000 g离心30 min，分离上清，置于-80℃保存。

3.1.2 酶活性测定

标准品依次浓度为360、240、120、60、30、15 mIU/L。以酶联免疫法测定大鼠肝脏组织中各酶活性，测定波长为450 nm。

3.2 肝脏Gstpi和NQO1 mRNA相对表达含量总RNA制备及RT-PCR实验

取适量肝脏组织，置于0.01%DEPC处理过的玻璃匀浆器中，加入1 mlTRIZOL后于冰浴上匀浆，得TRIZOL匀浆液后，每1 mLTRIZOL加入0.2 mL氯仿，剧烈震荡30 s后静置15 min，之后12000×g在4℃离心15 min，取上层清液，加入0.5 mL异丙醇，上下颠倒摇晃均匀后室温放置10 min，后12000 ×g在4℃离心10 min，弃去上清，加入0.8 mL以无水乙醇配制的75%乙醇，轻轻敲打后8000×g在4℃离心10 min，洗涤2次，之后弃去酒精，将EP管置于通风厨中吹干酒精，加入20μL Rnase/Dnase水，吹打数次，溶解后取出10 μL，加入590 μL灭菌水中，以UV4000测定RNA纯度及浓度。根据所测定RNA浓度使用TAKARA公司PrimescriptTM RT reagent依据使用说明反转录得到 cDNA，加入总RNA量为1 μg，反应体系为20 μL，并使用TAKARA公司SYBP Premix Ex TaqTMⅡ进行荧光定量PCR实验，实验使用仪器为ABI 7500 Real Time PCR System，扩增条件为95℃ 5 s，60℃34 s，40个循环。

引物:

Gstpi sense，AATGCCATCTTGAGGCACCTG;antisense，ATGAGGGTACCATATTTGCATCGAA;

NQO1 sense，TGGAAGCTGCAGACCTGGTG;an-tisense，TTGTCATACATGGTGGCATACGTG;

引物设计由GeneBank得到序列后设计，Gstpi，NM_012577.2，NQO1，NM_017000.3;产物扩增长度为:Gstpi-125 bp，NQO1-130 bp，β-actin-150 bp。

3.3 统计方法

实验结果以means±S.D.表示，以Dunnett's t test方法评价数据统计性差异，P＜0.05为有显著统计性差异。

4 结果

4.1 猪苓及猪苓多糖对实验大鼠肝脏CYP450、GST及NQO1酶活性测定

与正常组比较，猪苓多糖及猪苓50、250和500 mg/kg给药组肝脏微粒体中CYP450和GST酶活性明显降低，差异非常显著(P＜0.01);猪苓多糖及猪苓50和250 mg/kg给药组肝脏微粒体中NQO1酶活性明显升高，差异显著(P＜0.05或P＜0.01)。

表1 大鼠肝脏CYP450、GST及NQO1酶活性Table 1 Quantification of Liver CYP450，GST，NQO1 by ELISA assay in each group.

4.2 猪苓及猪苓多糖对实验大鼠肝脏 GSTPi，NQO1 mRNA相对表达含量

与正常组比较，猪苓多糖组及猪苓500 mg/kg组实验大鼠肝脏GSTPi mRNA相对表达含量上调，差异显著(P＜0.05);其它各组GSTPi及NQO1 mRNA表达均无显著性差异。

表2 大鼠肝脏GSTPi，NQO1相对表达含量Table 2 Quantification of Liver GSTPi，NQO1 expression by RT-PCR assay in each group

5 讨论

接触和摄入环境中的各种化学致癌物，如苯并芘、黄曲霉素、有机氯磷农药以及亚硝胺化合物等，是引发各种癌症的主要原因。化学致癌物多为脂溶性，从细胞和机体中清除的前提是必须提高其亲水性，该过程可分为Ⅰ期和Ⅱ期。首先经Ⅰ相代谢酶如细胞色素P450作用后，在疏水的化学致癌物中引入羟基;接着在肝脏Ⅱ相代谢酶如GST、NQO1、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGT)等的作用下，在已产生的羟基上再糖基化，进一步提高化合物的水溶性而促进其排出体外［2］。与Ⅰ相酶不同，Ⅱ相代谢酶的诱导不会增加致癌风险，因此诱导Ⅱ相代谢酶的活性是化学防癌的关键步骤［3，4］。

对细胞色素P450系的调控作用，在药物相互作用上扮演着至关重要的角色。从对细胞色素P450酶活性的影响看，猪苓多糖及猪苓均可使P450酶活性显著降低，其中猪苓对P450酶活性的抑制呈剂量依赖性。猪苓多糖为猪苓中降低P450酶活性的主要成分，其它成分有无降低P450酶活性作用及猪苓及其主要成分抑制P450酶活性具体亚型还有待深入研究。

Ⅱ相代谢酶主要有GST、NQO1等。流行病学研究证实Ⅱ相酶GST和NQO1的缺失或下降与人类膀胱癌发病风险密切相关［5-8］，敲除小鼠GSTPi和NQO1可诱导肿瘤［9-11］，二者在预防膀胱癌形成的过程中起到重要作用［7，12］。

诱导Ⅱ相代谢酶的活性是化学防癌的关键步骤。实验中，猪苓对可使NQO1酶活性显著降低，但高剂量猪苓却未对肝脏NQO1酶活性产生明显影响，说明此剂量下猪苓对肝脏NQO1酶活性无明显作用;猪苓多糖对肝脏NQO1酶活性也无明显作用。从模型组GST酶活性可以推测，BBN及糖精诱导性Fisher-344大鼠肝脏GST酶活性显著下降，实验中猪苓多糖及猪苓各剂量组均不能明显增加GST酶活性，与模型组比较，肝脏GST酶活性无显著差异，可推测猪苓多糖及猪苓对实验大鼠肝脏GST酶活性影响不大。

猪苓多糖及猪苓500 mg/kg有明显上升实验大鼠肝脏GSTPi mRNA相对表达含量作用，其它各组GSTPi mRNA相对表达含量与正常组比较未见明显作用。猪苓多糖组及猪苓各剂量组对大鼠肝脏NQO1 mRNA相对表达含量未见有明显作用。

GSTPi为GST酶系统中与膀胱癌发生密切相关的亚型酶，实验中猪苓多糖及猪苓500 mg/kg可明显上调 GSTPi mRNA表达，此结果与 GST总酶ELISA结果不同，显示猪苓多糖及猪苓高剂量可上调GSTPi mRNA表达，但对GST酶整体活性无明显作用。同样，与ELISA方法测定猪苓多糖及猪苓对实验鼠肝脏NQO1结果不同，猪苓多糖及猪苓对NQO1 mRNA表达无明显作用，结果暗示二者还有可能通过其它途径影响NQO1酶活性。

猪苓可显著降低大鼠肝脏CYP450酶活性，猪苓对CYP450酶活性呈剂量性依赖作用，猪苓中猪苓多糖为抑制CYP450酶活性成分之一;猪苓高剂量及猪苓多糖能升高GST亚型GSTPi活性，对总的GST酶活性影响并不明显;猪苓中低剂量可上升大鼠肝脏NQO1酶活性，猪苓多糖并无此作用，全部剂量猪苓对NQO1 mRNA无明显影响，猪苓对NQO1的升高作用可能还通过其它途径。

1 Zhang GW，Zeng X，Li CX，et al.Inhibition of urinary bladder carcinogenesis by aqueous extract of sclerotia of Polyporus umbellatus FRIES and Polyporus Polysaccharide.Am J chin Med，2011，39:135-144.

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Effects of Aqueous Extract of Sclerotia of Polyporus umbellatus and Polyporus Polysaccharide on Liver Metabolic Enzyme of Fisher-344 Rats Induced by BBN Combined Saccharin

ZHANG Guo-wei1，LI Cai-xia2，WANG Yan-feng3，HUANG Yu2，SU Zhi-jun4，ZHENG Fang2，ZENG Xing2*1College of Chinese Medicine，Hebei University，Baoding 071002，China;2Guangdong Provincial Academy of Chinese Medical Sciences，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China;3Sinopharm ChuanKong pharmaceutical CO.，LTD，Chengdu 610051，China;4Fugu Peoples Hospital of Shanxi，Fugu 719400，China

The present aimed to evaluate effects of sclerotia of P.umbellatus FRIES aqueous extract(SPUE)and Polyporus polysaccharide(PPS)on liver metabolic enzyme of Fisher-344 rat induced by N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine(BBN)combined saccharin.The rat liver enzyme activities of CYP450，glutathione S-transferase(GST)，and NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1(NQO1)were determined by ELISA.The relative expressions of liver glutathione S-transferase π(GSTPi)and NQO1 mRNA were measured with RT-PCR.The present report showed the SPUE and PPS decreased the activity of rat liver CYP450 enzyme，the effect had dose-effect relationship;they had no significant effect on the activity of rat liver GST enzyme，and they could increase the activity of rat liver NQO1 enzyme;the high dose SPUE could up-regulate the GSTPi mRNA relative expression in rat liver，they had no effect on the NQO1 mRNA relative expression in rat liver.In conclusion，the inhibition of bladder carcinogenesis by SPUE and PPS associate with the decreasing of rat liver CYP450 enzyme activity and increasing of NQO1 enzyme activity，but the mechanism needs further research.

sclerotia of Polyporus umbellatus;Polyporus polysaccharide;CYP450;Ⅱphase enzyme

1001-6880(2011)05-0923-04

2010-08-23 接受日期:2010-12-13

广东省科技计划项目(2010B030700059);河北大学科研基金资助项目(2101Q46);河北省卫生厅科研基金项目(20110514)

*通讯作者 Tel:86-20-39318678;E-mail:zengxing-china@163.com

R285.5

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