血管紧张素Ⅱ对大鼠血管平滑肌细胞T型钙通道及其信号转导通路的影响

王菁卓，姚旭哲，李斌，潘一龙，李晓东

（中国医科大学附属盛京医院心内科，沈阳110004）

血管紧张素Ⅱ对大鼠血管平滑肌细胞T型钙通道及其信号转导通路的影响

王菁卓，姚旭哲，李斌，潘一龙，李晓东

（中国医科大学附属盛京医院心内科，沈阳110004）

目的研究血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）对血管平滑肌细胞Cav3.1表达的影响及其作用机制。方法酶消化法原代培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞，应用第5代传代细胞，实验随机分为7组：对照组（不加任何药物）、AngⅡ组［加入AngⅡ（0.1 μmol/L）培养24 h］、AngⅡ+氯沙坦钾组［加入氯沙坦钾（1 μmol/L）培养1 h，再加入AngⅡ（0.1μmol/L）共同培养24 h］、AngⅡ+PD98059组［加入PD98059（10 μmol/L）预刺激1 h，再加入AngⅡ（0.1 μmol/L）共同培养24 h］、PD98059组［加入PD98059（10 μmol/L）培养1 h］、AngⅡ+氯沙坦钾+PD98059组［先加入氯沙坦钾（1 μmol/L），PD98059（10 μmol/L）培养1 h，再加入AngⅡ（0.1 μmol/L）共同培养24 h］、氯沙坦钾组［加入氯沙坦钾（1 μmol/L）培养4 h］。RT-PCR、Western blot方法测定各组T型钙通道的表达。结果PCR结果显示：与对照组（1.000±0.315）比较，AngⅡ组Cav3.1表达量（17.930±0.954）明显增加（P＜0.01）；PD98059组、氯沙坦钾组Cav3.1表达量为0.928±0.262、0.978±0.292，与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；AngⅡ+氯沙坦钾组、AngⅡ+PD98059组、AngⅡ+氯沙坦钾+PD98059组的Cav3.1表达量分别为0.125±0.007、0.066±0.015、0.109±0.018，明显低于AngⅡ组（P＜0.01）。Western blot结果显示：与对照组比较，AngⅡ+氯沙坦钾组、AngⅡ+PD98059组及AngⅡ+氯沙坦钾+PD98059组Cav3.1蛋白表达明显降低（P＜0.05）；而PD98059组及氯沙坦钾组Cav3.1蛋白表达与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论AngⅡ通过Ras/PKCζ/MEK/ERK1/2路径增加血管平滑肌细胞Cav3.1的表达。

T型钙通道；Cav3.1；血管平滑肌细胞；细胞增殖；血管紧张素Ⅱ

血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）作为肾素-血管紧张素-醛固酮系统中一个非常重要的肽类激素，参与了体内多种重要的病理生理过程，包括高血压、动脉粥样硬化及支架内再狭窄［1～4］等。这些病理生理的过程均与AngⅡ促进血管平滑肌的生长及增殖效应有关。既往的许多研究表明钙离子作为调节细胞生理功能的重要信号分子具有多种功能，例如细胞增殖、分化、分泌及细胞迁移等［5］。早期对于血管平滑肌细胞致血管性疾病的研究主要集中在收缩相关蛋白的基因调节机制上，近来则侧重于离子通道，特别是钙离子通道的改变机制上。目前发现分布在血管平滑肌上的钙通道有2种，即L型钙通道和T型钙通道［6］。关于L型钙通道在平滑肌细胞中病理生理学作用的研究目前已经趋于完善，已有研究［7］表明，L型钙通道在增殖或受损伤血管内的平滑肌细胞是减少的。还有研究［8］发现，在动脉硬化血管中，平滑肌细胞的L型钙通道不仅减少，而且伴随着表达的变异。人们在研究L型钙通道的同时，也发现了T型钙通道的表达在增殖型血管平滑肌细胞中是增加的，许多研究也表明T型钙通道与细胞周期的调控有着密切的联系［9，10］，这提示T型钙通道可能与细胞增殖有关。最近的研究直接表明：T型钙通道参与肺动脉平滑肌细胞增殖的调控［10］，这提示在血管平滑肌细胞的增殖过程中，T通道是必不可少的，但需要更多的证据。AngⅡ作为心血管事件链中的“罪魁祸首”具有强大的诱导细胞增殖的能力，但机制目前尚未完全阐述。赵亚丽等初次阐明了AngⅡ诱导平滑肌细胞增殖相对完整的信号转导途径［11］，这与Ferron等［12］发现的AngⅡ诱导心肌细胞T型钙通道重新表达的信号转导途径有着惊人的相似，但是目前对于AngⅡ对平滑肌细胞中T型钙通道的作用及其调控尚未见报道。本研究就“AngⅡ通过Ras/PKCζ/MEK/ERK1/2路径增加血管平滑肌细胞T型钙通道的表达”这一假设进行验证。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级Sprague-Dawley（SD）大鼠，雄性，6～8周龄，体质量160～180g，由中国医科大学附属盛京医院动物实验中心提供，适应性喂养7 d后处死。

1.2 方法

1.2.1 实验方法：（1）应用酶消化法原代培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞；（2）分组：培养的血管平滑肌细胞胰酶消化脱壁后，充分混合，随机分为7组：对照组（不加任何药物）、AngⅡ组（加入0.1 μmol/L AngⅡ培养24 h）、AngⅡ+氯沙坦钾组（加入1 μmol/L氯沙坦钾培养1 h，再加入0.1 μmol/L AngⅡ共同培养24 h）、AngⅡ+PD98059组（加入10 μ mol/L PD98059预刺激1 h，再加入0.1 μmol/L AngⅡ共同培养24 h）、PD98059组（加入10 μmol/L PD98059培养1 h）、AngⅡ+氯沙坦钾+PD98059组（先加入1 μmol/L氯沙坦钾，10 μmol/L PD98059培养1 h，再加入0.1 μmol/L AngⅡ共同培养24 h）、氯沙坦钾组（加入1 μmol/L氯沙坦钾培养4 h）；（3）RT-PCR、Western blot法检测血管平滑肌中Cav3.1的表达，所有操作步骤均按说明书进行。

1.2.2 细胞培养与鉴定：细胞培养参照文献［13］进行。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 大鼠血管平滑肌细胞鉴定

大鼠血管平滑肌细胞的鉴定在倒置相差显微镜下观察，血管平滑肌细胞呈梭形或多边形，核呈椭圆形或，胞质均质，有时可见核仁，细胞可重叠生长达多层，高低起伏，呈典型的“峰-谷”样生长。经平滑肌细胞特异性α-SMA免疫细胞化学染色，阳性细胞胞质中有棕黄色颗粒，阳性率约为95%，见图1。

2.2 RT-PCR法检测Cav3.1在各组大鼠血管平滑肌细胞中的表达

结果显示，AngⅡ组Cav3.1mRNA表达量（17.930±0.954）与对照组（1.000±0.315）比较增加明显，差异有统计学意义（P＜0.01）；PD98059组、氯沙坦钾组Cav3.1mRNA表达量分别为0.928±0.262、0.978±0.292，与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），表明单独的PD98059及氯沙坦钾对血管平滑肌细胞T型钙通道无明显影响；AngⅡ+氯沙坦钾组、AngⅡ+PD98059组、AngⅡ+氯沙坦钾+PD98059组Cav3.1mRNA表达量分别为0.125±0.007、0.066± 0.015、0.109±0.018，明显低于AngⅡ组，差异有统计学意义（P＜0.01），表明MEK1阻滞剂以及血管紧张素受体拮抗剂可以显著降低由AngⅡ诱导的血管平滑肌细胞Cav3.1表达。

图1 第5代大鼠主动脉血管平滑肌细胞免疫组化鉴定Fig.1 Immunohistochemical identification of the fifth generation vascular smooth muscle cells

2.3 Western blot检测Cav3.1在各组大鼠血管平滑肌细胞中的表达

对照组、AngⅡ组、AngⅡ+氯沙坦钾组、AngⅡ+ PD98059组、AngⅡ+氯沙坦钾+PD98059组、PD98059组及氯沙坦钾组血管平滑肌细胞中Cav3.1蛋白表达分别为1.000±0.315、1.000±0.053、0.125± 0.007、0.066±0.015、0.109±0.018、0.928±0.262、0.978±0.292。与对照组比较，AngⅡ+氯沙坦钾组、AngⅡ+PD98059组及AngⅡ+氯沙坦钾+PD98059组Cav3.1蛋白表达明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；而PD98059组及氯沙坦钾组Cav3.1蛋白表达与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见图2。由此结果显示，AngⅡ能够诱导血管平滑肌细胞过量表达T型钙通道，即T型钙通道过量表达是Ras/PKCζ/MEK/ERK1/2信号转导通路的下游蛋白产物。

图2 各组大鼠血管平滑肌细胞Cav3.1蛋白质相对表达量的比较Fig.2 Comparison of Cav3.1 protein relative expression in rat vascular smooth muscle cells among different group

3 讨论

T型钙通道镶嵌在细胞膜双脂质层中，是由α、β、γ、δ等多个亚单位组成的糖基化多肽复合体，各亚单位之间通过二硫键或非共价键相连，其中α分为α1和α2亚基。α1为钙通道的核心，它决定通道的电生理学性质。近年来已经克隆出3种T型钙通道α1亚单位的基因，即α1G、α1H和α1 I（新的命名为Cav3.1、Cav3.2和Cav3.3）。T型钙通道被激活时可引起细胞外Ca2+内流，而细胞内Ca2+浓度升高时可以激活Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶，后者激活后将产生一系列生理病理反应［14］。因为T型钙通道在动脉管壁、心肌传导组织及神经激素释放的部位含量较高，故T型钙通道在细胞生长和增殖中起着十分重要的作用。血管平滑肌细胞从血管中膜向内膜下迁移，并以自分泌、旁分泌形式分泌大量细胞因子和血管活性物质，是血管损伤后共同的病理生理过程［15］，在高血压、动脉粥样硬化、冠脉搭桥术后移植血管及血管成形术后局部血管的再狭窄等多种损伤性血管疾病的形成过程中起着重要作用。血管损伤后，局部血管壁AngⅡ的基因表达及蛋白合成均增加［16］，过度表达的AngⅡ通过与多种细胞因子、生长因子相互作用，启动了不同的细胞内信号转导系统，促进VSMC增殖、肥大并参与血管重塑［17］。已有研究证明，AngⅡ通过Ras/PKCζ/ MEK途径激活ERK1/2，是其诱导血管平滑肌细胞增殖的重要信号转导通路之一［18～20］。因此本实验基于以上研究，探讨AngⅡ对大鼠血管平滑肌细胞T型钙通道及其信号转导通路的影响。

本实验通过RT-PCR及Western blot技术测定大鼠血管平滑肌细胞Cav3.1表达，并得出结论：丝裂原活化蛋白激酶激酶1阻滞剂及血管紧张素受体拮抗剂亦可以显著降低由AngⅡ诱导的血管平滑肌细胞的Cav3.1mRNA及蛋白质的表达，这充分说明AngⅡ通过Ras/PKCζ/MEK/ERK1/2途径增加Cav3.1的表达，即Cav3.1过量表达是Ras/PKC ζ/MEK/ ERK1/2信号转导通路的下游蛋白产物。

已有研究证实，Ras/PKCζ/MEK/ERK1/2途径是AngⅡ诱导血管平滑肌细胞增殖的重要信号转导通路之一，本实验研究并证明了Cav3.1过量表达是Ras/PKCζ/MEK/ERK1/2信号转导通路的下游蛋白产物之一，但没有对T型钙通道的其他表型加以研究。

综上所述，T型钙通道在AngⅡ介导的细胞增殖中扮演了重要角色，AngⅡ强大的细胞诱导增殖能力，是通过Ras/PKCζ/MEK/ERK1/2信号转导通路，使大鼠血管平滑肌细胞中T型钙通道的Cav3.1过量表达引起的。因此转导通路与血管再狭窄的发生有着十分密切的关系［21］，本实验结果对将来血管再狭窄的防治有明确的指导意义。

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（编辑 武玉欣）

Influence of AngⅡon T-type Calcium Channelsand SignalTransduction Pathway in RatVascular Smooth Muscle Cells

WANGJing-zhuo，YAOXu-zhe，LIBin，PANYi-long，LIXiao-dong
（DepartmentofCardiology，Shengjing Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo investigate the effects ofAngⅡon T-type calcium channels in ratvascularsmooth muscle cells.MethodsPrimary culture ofrataortic vascularsmooth muscle cells was established by enzyme digestion method，and the fifth generation cells were used in the study.Cells were randomly divided into 7 groups：①controlgroup：withoutany drugs；②AngⅡgroup：AngⅡ0.1μmol/L for24 hours；③AngⅡ+losartan potassium group：losartan potassium 1μmol/L for1 hour，then add AngⅡ0.1μmol/Land cultures foranother24 hours；④AngⅡ+PD98059 group：adds 10 μmol/L PD98059 and stimulus for 1 hour，then adds 0.1 μmol/L AngⅡand cultures for 24 hours together；⑤PD98059 group：adds 10 μmol/L PD98059 and cultures for 1 hour；⑥AngⅡ+losartan potassium+PD98059 group：adds 1 μmol/L losartan potassium and 10 μmol/L PD98059 cultures for 1 hour，then adds 0.1 μmol/L AngⅡand cultures for 24 hours together；⑦losartan potassium group：adds losartan potassium and cultures for 4 hours.The expression of T-type calcium channel of every group was determined by PT-PCR and Western blot.Results①PCR results showed that the expression of Cav3.1 in AngⅡgroup（17.930±0.954）increased significantly compared with control group（1.000±0.315）（P＜0.05），which were notobserved in PD98059 group（2-ΔΔCt：0.928±0.262）and losartan potassium group（2-ΔΔCt：0.978±0.292）；the expression of Cav3.1 in AngⅡ+losartan potassium group（0.125±0.007），AngⅡ+PD98059 group（0.066±0.015）and AngⅡ+losartan potassium+PD98059 group（0.109±0.018）significantly lower than AngⅡgroup（1.000±0.053）（allP＜0.01）。②Western blot result showed that the expression of Cav3.1 in AngⅡ+losartan potassium group，AngⅡ+losartan potassium+PD98059 group and AngⅡ+PD98059 group is significantly reduced compared with the control group；while no obvious statistical significance was found between PD98059 group and losartan potassium group（P＞0.05）.ConclusionAngiotensinⅡcan lead excessive expression of T-type calcium channel in rat vascular smooth muscle cells；However，there isno statistically significantdifferencescompared with the controlgroup.

T-type calcium channel；Cav3.1；vascular smooth muscle cell；cell proliferation；angiotensinⅡ

R329.2+8

A

0258-4646（2014）09-0802-04

辽宁省教育厅高校科研计划（L2013314）

王菁卓（1988-），女，硕士研究生.

李晓东，E-mail：lxd@medmail.com

2014-06-17

网络出版时间：