变性再复性方法提取高纯度Cav1.2片段GST-CT1及其生物活性的鉴定

孙宇，封瑞，孙威，胡慧媛，郝丽英

（中国医科大学药学院药物毒理教研室，沈阳110001）

变性再复性方法提取高纯度Cav1.2片段GST-CT1及其生物活性的鉴定

孙宇，封瑞，孙威，胡慧媛，郝丽英

（中国医科大学药学院药物毒理教研室，沈阳110001）

目的探寻诱导谷胱甘肽转移酶（GST）与Cav1.2钙通道片段CT1重组的易形成包涵体的大分子融合蛋白的提取与纯化的方法。方法在E.coliBL21中转化入pGEX-6p-3/CT1重组质粒并诱导表达，采用GST包涵体变性复性试剂盒和非离子去污剂B-PER分离纯化GST-CT1融合蛋白，用Pull down assay方法鉴定GST-CT1融合蛋白及其生物活性。结果应用GST包涵体变性复性试剂盒和非离子去污剂B-PER能够分离得到高纯度的易形成包涵体的GST-CT1融合蛋白，且分离纯化的GST-CT1融合蛋白具有与钙调蛋白结合的生物活性。结论操作简易的GST包涵体变性复性法能够针对易形成包涵体的GST-CT1融合蛋白进行分离和纯化，且得到的蛋白具有生物学活性。

包涵体；变性再复性；钙离子通道

心肌细胞L型电压依赖性钙离子通道（L-type voltage-dependent calcium channel，LTCC）是钙离子（Ca2+）进入心肌细胞的主要途径，在维持细胞Ca2+平衡中起着至关重要的作用［1，2］。在生理情况下，LTCC介导的Ca2+内流在心肌细胞兴奋收缩耦联、钙触发钙释放及动作电位形成等过程中发挥着重要作用，另外，还参与可兴奋细胞神经递质的分泌、释放和自我调控转录［3～6］。心肌细胞LTCC调节的失衡会引发心律失常、心房颤动和心力衰竭等一系列病理过程。近年来，研究者对心肌LTCC的调节机制进行了广泛深入的研究。研究表明，LTCC可以被蛋白激酶A（proteinkinase A，PKA）、钙调蛋白（calmodulin，CaM）、钙结合蛋白1（Ca2+-bingding protein 1，CaBP1）、钙蛋白酶抑素（calpastatin，CS）、钙调蛋白激酶Ⅱ（Ca2+/calmodulin-dependent kinaseⅡ，CaMKⅡ）等多种细胞因子调节［7～11］。LTCC的C末端CT1（a.a.1509～1789）上有磷酸化和蛋白质结合位点，PKA能够通过CT1上的磷酸化位点使LTCC磷酸化，从而对心肌细胞LTCC进行调节；CaM、CaBP1、CS、CaMKⅡ等蛋白能够直接或间接与CT1上的蛋白结合位点结合，从而对LTCC进行调节。因此获得CT1片段对于研究LTCC具有重要的意义。

大肠埃希菌因其具有操作简单、成本低、生长快、产量高等优点而被广泛应用于重组蛋白的表达。GST标签的CT1重组蛋白（GST-CT1）在经大肠埃希菌诱导大量表达的情况下，通常会形成无活性的包涵体，在蛋白质提取纯化的过程中以难溶状态存在，大大降低了重组蛋白提取的产量。目前，包涵体形成的原因并不十分清楚，可能是易形成包涵体的蛋白部分错误折叠而导致。目前，针对包涵体蛋白的提取方法主要有亲和层析法、变性法等方法，上述方法因具有耗时、规模大、出现不可逆的变性等缺点而不能广泛应用。因此，本研究拟采用技术简单、操作方便的B-PER破膜［12］，并针对GST-CT1蛋白提取纯化过程中易形成包涵体这一难题，运用包涵体变性再复性试剂盒有效地提取纯化高纯度、高产量的GST-CT1蛋白，并运用pull-down assay鉴定GST-CT1及其生物学活性。为今后LTCC的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

原核表达载体pGEX-6p-3和BL21菌种购自Amersham Pharmacia Biotech公司。B-PER购自Thermo Scientic公司，蛋白酶抑制剂购自Roche Applied Science公司，氨苄西林（ampicillin sodium）、IPTG、溶菌酶（lysozyme）、DTT均购自Wako公司，Glutathione-Sepharose 4B beads、PreScission Protease、Turbo Nuclease购自GE Healthcare公司，GST包涵体变性试剂盒（Rapid GST inclusion body solubilization and renaturation kit）购自Cell Biolabs，INC公司。

1.2 方法

1.2.1 重组质粒pGEX-6p-3/CT1的诱导及表达：将重组质粒pGEX-6p-3/CT1转化到BL21中，于含有0.1 mg/mL氨苄西林（AMP）的LB培养液中培养，37℃、100 r/min震荡过夜。将菌液稀释至OD值0.6～0.8之间，再加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，37℃、100 r/min震荡5 h，诱导表达GST-CT1。

1.2.2 变性再复性方法提取与纯化GST-CT1：6 000 r/min离心菌液15 min，收集沉淀。将沉淀重悬［每克沉淀加入4 mL B-PER，0.2 mg/mL溶菌酶（lysozyme），1 μL DNA酶（Turbo nuclease）和蛋白酶抑制剂］，室温振荡孵育30 min以促进细菌破膜、DNA溶解及GST-CT1蛋白的释放。16 000 r/min离心20 min，将上清置于冰上，留取少量标记为S，剩余的上清用300 μL STE缓冲液洗过的GS-4B beads 4℃孵育过夜。取少许沉淀，用Tris溶解标记为P。将S、P分别经1×loading缓冲液处理，80℃加热5 min，经12.5%SDS-PAGE电泳（上样量均为10 μg），以确定此时GST-CT1是主要存在于上清或沉淀中。

将上述离心后的沉淀用变性复性试剂盒的20 mL 1×STE缓冲液，1 mmol/L DTT，0.2 mg/mL溶菌酶和蛋白酶抑制剂重悬，加入变性试剂，4℃摇晃1 h，使错误折叠的包涵体蛋白结构打开而变为水溶性。再加入复性试剂，使GST-CT1按照正确的方式折叠而以可溶的形式存在。加入STE缓冲液洗过的300 μL GS-4B beads，4℃孵育过夜。将上清提取的GST-CT1与变性再复性方法提取的GST-CT1分别800 r/min离心3 min，弃上清。依次用5 mL PBS和Tris各洗2次，用含有蛋白酶抑制剂的Tris buffer稀释，4℃保存。牛血清蛋白为标准品，Bradford法测蛋白浓度。

1.2.3 变性再复性方法提取纯化的GST-CT1蛋白及纯度的鉴定：取上述方法制备的GST-CT1蛋白，经1×loading缓冲液处理后，80℃加热5 min，进行12.5%SDS-PAGE电泳（上样量均为10 μg），根据Marker检测CT1蛋白。

1.2.4 pull down assay鉴定GST-CT1蛋白生物学活性：检测当CaM的浓度分别为0.1、0.3、1、3和10 μmol/L时GST-CT1与CaM的结合情况。每400 μL体系包含10 μg GST-CT1蛋白，2 mmol/L CaCl2，蛋白酶抑制剂，不同浓度的CaM，溶于Tris buffer中。4℃摇晃孵育3 h。将孵育好的样品用含0.05% Tween-20、蛋白酶抑制剂和2 mmol/L CaCl2的Tris缓冲液500 μL洗2次后，用1×loading缓冲液处理，室温静置20 min，80℃加热5 min。12.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳，按照CaM浓度由低到高的顺序依次上样。考马斯亮蓝染胶1 h后，脱色液脱色，照相。应用Image J软件分析灰度值。

2 结果

2.1 GST-CT1蛋白提取纯化过程中以不可溶的包涵体形式存在于沉淀之中

将B-PER破膜处理的菌液离心后的上清S和沉淀P（各10 μg）分别进行12.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳，经考马斯亮蓝染色后，可见GST-CT1大部分存在于沉淀之中（图1）。说明GST-CT1作为大分子蛋白，在提取纯化过程中以不可溶的包涵体形式存在于沉淀中，上清中虽然也存在GST-CT1蛋白，但与沉淀相比所含有的GST-CT1蛋白含量非常少。

2.2 经变性再复性方法提取纯化的GST-CT1蛋白

采用变性再复性方法提取的GST-CT1蛋白及破膜离心后的上清提取的GST-CT1蛋白进行12.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳（上样量10 μg），考马斯亮蓝染色。如图2所示：经变性再复性方法提取纯化的GST-CT1蛋白产量明显提高，且此方法提取的GSTCT1蛋白杂带较少，纯度较高。上清液中提取的GST-CT1蛋白非常少，且主要为GST蛋白。说明用该方法提取的GST-CT1蛋白遗失率少，能够尽可能多地将菌液中的GST-CT1提取出来。由此可见，变性再复性方法能够提取出高浓度、高产率、高纯度的GST-CT1蛋白。

图1 GST-CT1蛋白的存在位置Fig.1 Location of the GST-CT1

2.3 经变性再复性试剂盒方法提取的GST-CT1蛋白生物活性的鉴定

图2 经变性再复性方法提取的GST-CT1蛋白Fig.2 Purification of GST-CT1 by denaturation and renaturation method

将变性再复性试剂盒方法提取的GST-CT1蛋白，与不同浓度的CaM蛋白孵育，进行12.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳（GST-CT1上样量10 μg），经考马斯亮蓝染色、灰度值分析后，结果如图3所示：用变性复性方法提取的GST-CT1蛋白能够与CaM浓度依赖性的结合，表明GST-CT1具有正常的生物学活性。

图3 GST-CT1蛋白与CaM呈浓度依赖性结合Fig.3 GST-CT1 bind to CaM in concentration dependent manner

3 讨论

随着心肌LTCC研究的不断深入，CT1片段在LTCC调节过程中的重要性逐渐被人们所发现。CT1除了能与CaM、CaBP1、CS及CaMKII等经典的调节蛋白结合外，最新研究表明三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）在豚鼠心肌细胞中也能以浓度依赖的方式与CT1片段结合从而对LTCC进行调节，并且这种结合也呈Ca2+和CaM依赖性［13］。CT1不仅能够与各种调节蛋白结合而改变LTCC的活性，而且H2O2和H2S等氧化还原剂也能够改变CT1片段上氨基酸残基的氧化还原状态，从而对LTCC的活性做出调节［1，14］。可见CT1片段在LTCC的调节过程中发挥着至关重要的作用。

GST-CT1易形成包涵体而以难溶的形式存在，因此较难提取纯化出高纯度、高产量蛋白，对于这一难题目前尚无良好的解决方法。变性方法作为一种改进方法，被应用于提取纯化GST-CT1蛋白，应用十二烷基肌胺酸钠（N-lauroylsarcosine sodium salt）阴离子表面活性剂作为变性剂，打开错误折叠的GST-CT1蛋白而使其以可溶形式存在，从而提高蛋白产量。该方法的优点在于提取出的蛋白浓度、纯度都相对较高，且经济成本较低、适合大规模生产操作［12，15］。变性剂虽然能打开错误折叠的GSTCT1蛋白结构而使其变为可溶，但是被打开的蛋白质失去了其原有的空间结构，在变性条件去除的情况下，GST-CT1蛋白会进行缓慢的自然复性过程，但是这一复性效率很低，不能完全恢复其原有的正常空间结构，因此会在一定程度上影响蛋白质的生物活性。

鉴于上述变性法的局限性，本研究在变性的基础上又对蛋白进行了复性，即应用变性再复性方法提取纯化GST-CT1蛋白。运用试剂盒中的变性试剂对形成包涵体的GST-CT1蛋白进行变性修饰，将错误折叠的蛋白质空间结构打开而变为线性可溶形式，随后又应用试剂盒中的复性试剂将变性后的GST-CT1蛋白按照正确的方式折叠恢复其正常的空间结构，在提取纯化过程中以可溶形式存在，大大提高了GST-CT1蛋白产量。本研究方法通过尿素等小分子添加剂阻止蛋白的聚集，稳定蛋白质的活性，使不正确折叠的蛋白质结构变得不稳定，而向正确的方向进行折叠，可大幅度提高包涵体蛋白质的折叠效率。该方法提取的蛋白不仅浓度高、纯度高、产率高，且pull-down方法显示该GST-CT1蛋白能够与CaM浓度依赖性的结合，具有正常的生物学活性。

综上所述，本研究方法操作简单、省时，而且没有pH值的变化和氧化还原对的参与，为LTCC的研究奠定了基础。虽然该方法具有诸多优点，但实验经济成本投入较高。因此，在实验研究中，应该根据具体需要选择合适的蛋白提取纯化方法。

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（编辑 王又冬）

The Method ofDenaturation and Renaturation for Purifying CT1 FragmentofCav1.2 and the Identification ofIts Biologic Activity

SUNYu，FENGRui，SUNWei，HUHui-yuan，HAOLi-ying
（DepartmentofPharmaceuticalToxicology，SchoolofPharmacy，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo explore methods for the extraction and purification of the inclusion body of fusion protein of glutathione transferase（GST）and CT1 fragment of Cav1.2，and to investigate its biologic activity.MethodsPGEX-6p-3 recombinant plasmid was transfected intoE.coliBL21 to express.GST-CT1 fusion protein with GSTinclusion body waspurified by solubilization and renaturation kitand B-PER.The biologic activity of GST-CT1 fusion protein was identified by pull down assay.ResultsThe GST-CT1 fusion protein，which is easy to form inclusion body，was successfully purified by the established method and pull down assay showed that the purified protein can bind to calmodulin protein.ConclusionThe GST-CT1 fusion protein was successfully purified by denaturation and renaturation method and also showed its normalbiologic activity.

inclusion body；denaturation and renaturation；calcium channel

R96

A

0258-4646（2014）09-0777-04

国家自然科学基金（31071004，81100108）

孙宇（1989-），女，硕士研究生.

郝丽英，E-mail：haoliying2006@163.com

2014-06-04

网络出版时间：