神经肽Y及其Y1受体在遗传性癫痫大鼠脑内的表达及意义

徐晓雪，郭凤，王千慧，张朝东，杨军，赵久晗，蔡际群

（中国医科大学1.附属第一医院神经内科；2.神经病学研究所；3.药学院药物毒理教研室，沈阳110001）

神经肽Y及其Y1受体在遗传性癫痫大鼠脑内的表达及意义

徐晓雪1，2，郭凤3，王千慧3，张朝东1，2，杨军1，2，赵久晗1，2，蔡际群3

（中国医科大学1.附属第一医院神经内科；2.神经病学研究所；3.药学院药物毒理教研室，沈阳110001）

目的探讨遗传性癫痫大鼠（TRM）海马和颞叶皮质中神经肽Y（NPY）及其Y1受体（Y1R）的表达和分布。方法逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测NPY和Y1RmRNA表达。ELISA试剂盒法检测TRM和Wistar大鼠海马和颞叶皮质中NPY浓度。Western blot检测Y1R蛋白表达。免疫荧光双标记法分析TRM及Wistar大鼠海马CA1、CA3和DG区以及颞叶皮质中NPY与Y1R的分布和共定位。结果ELISA和RT-PCR结果均显示，TRM海马和颞叶皮质中NPY表达明显上调，与Wistar大鼠比较差异有统计学意义（P＜0.01）。Western blot结果证实，TRM海马中Y1R蛋白表达明显低于Wistar大鼠，而在颞叶皮质中显著高于Wistar大鼠。免疫荧光分析发现NPY与Y1R在TRM海马CA1、CA3区神经元细胞和DG区颗粒细胞以及颞叶皮质神经元细胞中分布广泛，并存在共定位且主要定位在细胞膜上。结论在TRM海马和颞叶皮质中，NPY及其Y1R表达出现异常变化，而这种异常表达可能与TRM癫痫发生机制有关。

癫痫；神经肽Y；Y1受体；亚型；海马；颞叶皮质

癫痫是一种以大脑神经元异常放电为特征的神经系统常见疾病［1］，其发病机制非常复杂，至今没有完全阐明。近年研究发现诱发癫痫发病的主要因素除了与神经元兴奋性异常增高有关，还可能与机体自身缺乏有效的抑制性神经信息传递有密切联系。神经肽Y（neuropeptide Y，NPY）是由36个氨基酸构成的一种活性多肽。由Lund berg等［2］于1982年首次从猪脑中提取，在哺乳动物中枢神经系统中NPY是含量最丰富的多肽之一。由于其在海马结构中浓度最高，并且能够与经典的抑制性氨基酸γ-氨基丁酸共存，因此NPY被认为是一种内源抑制性神经肽，参与调节神经元兴奋性［3］。Y1受体（Y1 receptor，Y1R）是重要的NPY受体亚型，属于G蛋白偶联受体家族，广泛分布在海马、皮质等部位的中间神经元中。在红藻氨酸致痫模型中，NPY与Y1R结合后，可以通过G蛋白降低神经元兴奋性［4］。而在不同的致痫模型中，NPY及其Y1R的表达和功能也可能有差异。

由日本京都大学首次发现的遗传性癫痫大鼠（Tremor rat，TRM）在10号染色体上存在Tm基因突变，出生8周后无需外加物理化学因素刺激而出现自发性抽搐以及失神样的癫痫发作，是研究癫痫小发作的理想模型［5，6］。目前关于TRM脑内NPY及其受体的表达变化未见报道。因此，本研究拟利用分子生物学检测方法探讨NPY及其Y1R在TRM癫痫发生中的作用，为进一步开发抗遗传性癫痫特异性药物和基因治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

日本京都大学馈赠TRM种鼠，由中国医科大学自行繁殖；健康Wistar大鼠由中国医科大学实验动物部提供。模型组TRM和对照组Wistar大鼠均为9～12周龄，雌雄不限，在每项实验中各8只。TRIzol购自美国Sigma公司，NPY、Y1R和GAPDH引物由TaKaRa公司合成，ELISA试剂盒购于武汉优尔生公司，一抗NPY小鼠单克隆抗体和Y1R兔多克隆抗体购自美国ABCAM公司，一抗GAPDH小鼠单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。

1.2 逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）检测NPY与Y1RmRNA水平表达

TRM和Wistar大鼠麻醉后断头，迅速取出全脑，剥离海马和颞叶皮质，参照TRIzol说明书提取总RNA，紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度。取1 μg总RNA样本模板于10 μL逆转录反应体系中，参照TaKaRa逆转录反应试剂盒操作。反应条件为37℃反应15 min，85℃反应5 s，反应体积为25 μL。采用GAPDH为内参，反应条件为95℃反应45 s，60℃反应50 s，72℃反应90 s，72℃反应5 min，共30个循环。阴性对照模板为ddH2O，其余体系组分以及反应条件均与实验组相同。反应产物经2%琼脂糖凝胶电泳后分析比对灰度值。以NPY和Y1R与GAPDH灰度值的比值为mRNA相对表达量。各目的基因PCR反应引物序列：NPY：上游5′-TAGGT AACAAACGAATGGGG-3′，下游5′-AGGATGAGAT GAGATGTGGG-3′；Y1R：上游5′-CGTTAGGCCATT CACAAGAATGAAG-3′，下游5′-ATGCTCTGATGAG CGATGCAA-3′；GAPDH：上游5′-GGCACAGTCAAG GCTGAGAATG-3′，下游5′-ATGGTGGTGAAGACGC CAGTA-3′。

1.3 ELISA试剂盒检测NPY蛋白浓度

乙醚麻醉TRM和Wistar大鼠，断头取脑后快速分离海马和颞叶皮质。提取总蛋白并测浓度，将所用样品浓度统一稀释到3 μg/μL。其余步骤按照ELISA试剂盒说明书操作。所有试剂盒内试剂和样品室温平衡30 min。在确保酶标板板底无水滴和孔内无气泡后，立即用酶标仪在450 nm波长测量各孔的光密度值。

1.4 Western blot检测Y1R蛋白水平表达

将剥离的海马和颞叶皮质加入RIPA裂解液以及蛋白酶抑制剂混合物，匀浆超声后低温离心取上清液，提取样本总蛋白用BCA法测定蛋白浓度，加入上样缓冲液煮沸变性后取60 μg/孔，5%浓缩胶和12%分离胶进行SDS-PAGE电泳，浓缩胶电压80 V 60 min，分离胶电压120 V 80 min。之后转印至PVDF膜（200 mA，1.5 h）。5%BSA常温封闭1 h后分别加入一抗Y1R（1∶500）和GAPDH（1∶1 500），4℃过夜孵育。次日TBST洗膜后，加入相应的二抗（羊抗兔1∶3 000，羊抗小鼠1∶3 000），37℃孵育1 h，TBST洗膜后ECL化学发光，测定分析灰度值，将Y1R与GAPDH灰度值的比值作为蛋白相对表达量。

1.5 免疫荧光双标记染色检测NPY与Y1R分布

TRM和Wistar大鼠麻醉后，4%多聚甲醛心脏灌流，迅速取脑，4%多聚甲醛固定24 h，30%蔗糖沉糖24 h OCT复合物包埋，冰冻切片机进行10 μm厚的连续冠状切片。0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次10 min，1%正常牛血清蛋白及0.2%Triton X-100孵育90 min，分别加入兔抗Y1R（1∶50）和小鼠抗NPY一抗（1∶40）混合物，4℃湿盒过夜。次日PBS清洗，在暗室中加入FITC标记羊抗兔（1∶200）和Cy3标记羊抗小鼠（1∶200）二抗混合物，避光孵育2 h后加入DAPI（1∶500）标记细胞核并封片。400倍荧光显微镜下观察并统计阳性细胞数。阴性对照一抗由PBS代替，其余步骤均相同。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 NPY在TRM海马和颞叶皮质中表达上调

利用RT-PCR检测NPY在TRM脑内mRNA水平表达，如图1结果显示，NPY在TRM和Wistar大鼠中的相对灰度值海马分别为0.76±0.10和0.43±0.08，颞叶皮质分别为0.74±0.08和0.49±0.10。说明相较于Wistar大鼠，TRM海马和颞叶皮质中NPYmRNA相对表达量出现显著上调（均P＜0.01）。

由于NPY的分子量很小，因此选择ELISA试剂盒分析NPY在TRM脑内的蛋白浓度，结果显示，TRM海马和颞叶皮质中的NPY含量分别为（56.93±3.77）和（48.12±3.13）pg/mL，Wistar大鼠分别为（23.18±2.15）和（19.17±2.32）pg/mL，TRM海马和颞叶皮质中的NPY含量均比Wistar大鼠相应部位含量多（均P＜0.01）。与RT-PCR实验结论基本一致。

2.2 Y1R在TRM海马和颞叶皮质中表达异常

RT-PCR检测TRM脑内Y1RmRNA水平表达。如图1显示，在TRM和Wistar大鼠海马中，Y1RmRNA表达相对灰度值分别为0.52±0.12和0.90± 0.12，而在颞叶皮质中分别为0.91±0.08和0.59± 0.11。说明相较于Wistar大鼠，Y1RmRNA水平表达在TRM海马中显著降低，而在其颞叶皮质中则明显增高（均P＜0.01）。

图1 RT-PCR检测NPY和Y1R在各组大鼠脑内的表达Fig.1 The mRNA expression of NPY and Y1R in TRM and Wistar brain subareas detected by RT-PCR

图2 Western blot检测Y1R在各组大鼠脑内的蛋白表达Fig.2 The protein expression of Y1R detected by Western blot in TRM and Wistar brain subareas

Western blot检测TRM脑内Y1R蛋白水平表达。如图2显示，TRM海马和颞叶皮质中Y1R蛋白表达相对灰度值分别为0.50±0.06和0.49±0.04，而Wistar大鼠分别为0.79±0.08和0.35±0.04，说明相较于Wistar大鼠，Y1R蛋白水平表达在TRM海马中明显下降，而在其颞叶皮质中则显著升高（均P＜0.01）。进一步验证了RT-PCR实验结论。

2.3 免疫荧光双标记法检测TRM脑内NPY与Y1R分布

免疫荧光检测了NPY和Y1R在TRM脑内的分布以及共定位情况。如图3显示，NPY和Y1R在TRM海马CA1、CA3、DG区以及颞叶皮质区都有广泛的分布和共定位，包括CA1和CA3锥体细胞层以及DG区的颗粒细胞层。其中Y1R主要定位在细胞膜以及神经元部分轴突上。通过统计100个细胞中的阳性细胞数我们发现，相较于Wistar大鼠，Y1R与NPY共定位的阳性细胞在TRM海马CA1和CA3数量显著减少，在DG的数量无明显变化，但是在颞叶皮质区数量增多，见表1。

表1 TRM脑内不同部位中NPY与Y1R共定位阳性细胞数统计Tab.1 The number of positive cells with co-localized NPY and Y1R in TRM brain subareas

3 讨论

本研究的主要目的是研究NPY和Y1R在TRM海马和颞叶皮质的表达和分布。我们首次发现相较于正常Wistar大鼠，NPY在TRM海马以及颞叶皮质中表达异常增加，Y1R在TRM海马中表达明显减少，而在颞叶皮质中表达显著上调。免疫荧光双标记检测结果也证实，NPY和Y1R在TRM海马CA1、CA3和DG以及颞叶皮质区域都有广泛的分布和共定位。

作为一种突触前抑制剂，NPY能够通过抑制谷氨酸的释放来调控神经元兴奋性。因此当癫痫发作造成神经元损伤时，NPY介导的内源性神经保护功能可能被启动。在红藻氨酸注射诱导致痫的大鼠模型中，在海马中间神经元能够观察到NPY表达的持续增加［7，8］。这与我们的实验结果基本一致。Mao等［9］前期研究发现TRM脑内谷氨酸和γ-氨基丁酸浓度失衡。因此推测，NPY的异常表达增加可能是机体内源性的保护作用。目前，已有相关报道通过外源性注射NPY以及利用腺病毒携带人工高表达NPY基因的质粒都能够达到抗癫痫的功效［10，11］，进一步验证了NPY对于癫痫治疗的重要价值。

图3 免疫荧光染色检测NPY与Y1R在TRM脑内的分布与定位×400Fig.3 The co-localizations of NPY and Y1R in TRM and Wistar brains by double-labeled immunofluorescence staining×400

癫痫诱发的NPY异常表达与NPY受体的表达变化有密切关系。Y1R是大量存在于海马和颞叶皮质突触后神经元上的受体［12］，对维持机体内部的能量环路平衡发挥重要作用。Husum等［13］认为，在电休克致痫模型中阻碍Y1R的活性可抑制细胞内NPY的释放。但是由于Y1R在不同致痫模型中表达变化有差异，因此其在癫痫发生中扮演的角色一直存在争议。例如在癫痫患者发作后，有研究发现其颗粒细胞层中的Y1R表达急剧下降以及Y1R阳性神经元的缺失与损伤。这与我们在TRM海马中观察到的结果类似。但是在Noda癫痫大鼠中，Y1R在海马中的表达却出现明显增加［14］。还有体内试验认为NPY能够通过Y1R的作用增加谷氨酸的释放，但并不影响或阻碍其抗癫痫功能［15］。这说明不同的癫痫模型中Y1R的表达变化可能不一致，再一次验证了癫痫发生机制的复杂性。我们推测，TRM海马中Y1R表达减少可能有助于NPY神经保护功能的启动和发挥，而其在颞叶皮质中的表达增加则有可能是机体的一种代偿作用。

综上，本研究首次发现与正常Wistar大鼠相比，NPY在TRM海马和颞叶皮质部位表达明显增加；Y1R在TRM海马表达下调，而在颞叶皮质中表达上调。TRM脑内NPY介导的神经保护功能可能没有受到损伤并正常启动。而Y1R的异常表达可能有助于NPY发挥抗癫痫作用。但是这种保护没有完全抵御TRM癫痫的发生。这可能是由于NPY表达量仍然不足，也有可能是其他关键蛋白例如蛋白激酶C的异常表达阻碍了NPY抑制兴奋性氨基酸释放的功能。但是无论哪种推测都需要进一步验证。

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（编辑 陈姜）

Expressionsand Co-localizationsofNeuropeptide Y and Y1 Receptor in Brain ofTremor Rats

XUXiao-xue1，2，GUOFeng3，WANGQian-hui3，ZHANGChao-dong1，2，YANGJun1，2，ZHAOJiu-han1，2，CAIJi-qun3
（1.Department of Neurology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Institute of Neurology，China Medical University，Shenyang 110001，China；3.DepartmentofPharmaceuticalToxicology，SchoolofPharmacy，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo explore the expression and distribution of neuropeptide Y（NPY）and Y1 receptor（Y1R）in brain of Tremor rats（TRM）.MethodsThe mRNA expression ofNPYandY1Rwas detected by RT-PCR.The concentration of NPY was detected by ELISA kit.The protein expression of Y1R was determined by Western blot in TRM hippocampus and temporal lobe cortex.The distribution and co-localization of these two proteins were analyzed using double-labeling immunofluorescence staining in temporal lobe cortex and hippocampal CA1，CA3，and DG.ResultsCompared with Wistar rats，increased NPY and decreased Y1R were observed in the hippocampus of TRM.However，both NPY and Y1R were up-regulated in TRM temporal lobe cortex.NPY and Y1R were present and co-localized throughout TRM brains，especially localized on the membranes of pyramidal cells and granule cells.ConclusionThe altered expressions of NPY and Y1R were observed in TRM hippocampus and temporallobe cortex，which may be involved in the generation ofTRMepileptiform activity.

epilepsy；neuropeptide Y；Y1 receptor；subtype；hippocampus；temporal lobe cortex

R742.1

A

0258-4646（2014）09-0794-05

国家自然青年科学基金（81001429）

徐晓雪（1983-），女，助理研究员，博士. E-mail：xiaoxue80cn@sina.com

2014-06-23

网络出版时间：