葡萄糖调节蛋白78和基质金属蛋白酶在口腔鳞状细胞癌中的表达

王波，汲坤，张丽艳，尚德志，侯君妍，华正伟

（1.内蒙古民族大学第二临床医学院病理科，内蒙古民族大学分子病理学研究所，内蒙古林业总医院病理科，内蒙古牙克石022150；2.沈阳医学院病理生理学教研室，沈阳110034；3.沈阳医学院颌面外科，沈阳110034；4.沈阳医学院2011级口腔医学，沈阳110034）

葡萄糖调节蛋白78和基质金属蛋白酶在口腔鳞状细胞癌中的表达

王波1，汲坤2，张丽艳2，尚德志3，侯君妍4，华正伟4

（1.内蒙古民族大学第二临床医学院病理科，内蒙古民族大学分子病理学研究所，内蒙古林业总医院病理科，内蒙古牙克石022150；2.沈阳医学院病理生理学教研室，沈阳110034；3.沈阳医学院颌面外科，沈阳110034；4.沈阳医学院2011级口腔医学，沈阳110034）

目的探讨葡萄糖调节蛋白78（GRP78）和基质金属蛋白酶（MMPs）在口腔鳞状细胞癌组织中的表达及意义，阐明GRP78在口腔鳞状细胞癌发生、发展中的作用。方法采用免疫组织化学方法检测26例口腔鳞状细胞癌组织和10例正常口腔组织中GRP78蛋白的表达；采用逆转录PCR检测正常口腔组织和口腔鳞状细胞癌组织中GRP78mRNA的表达；采用免疫组织化学方法检测26例口腔鳞状细胞癌组织中MMP-2和MMP-9蛋白的表达。结果GRP78蛋白在口腔鳞状细胞癌组织中的阳性表达率为100%（26/26），在正常口腔组织中的阳性表达率为20%（2/10），两者比较差异有统计学意义（P＜0.01）；与高分化和中分化口腔鳞状细胞癌组织比较，低分化口腔鳞状细胞癌组织中的GRP78蛋白阳性表达强度明显增高（P＜0.05）。与正常口腔组织比较，GRP78mRNA表达水平在口腔鳞状细胞癌组织中的表达增高（P＜0.05）。MMP-2和MMP-9蛋白在口腔鳞状细胞癌组织中的阳性表达率均为100%（26/26）。结论GRP78和MMPs在口腔鳞状细胞癌组织中表达明显升高，提示口腔鳞状细胞癌中GRP78蛋白的表达可能与肿瘤的侵袭和转移相关。

口腔鳞状细胞癌；葡萄糖调节蛋白78；基质金属蛋白酶

口腔癌是一种常见的恶性肿瘤，其发病率约占全身恶性肿瘤的3%左右［1］，其中90%为鳞状细胞癌。葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78）是由内质网合成、分泌的一种蛋白质，属于热休克蛋白70家族。近年来随着研究的不断深入，人们发现GRP78除了驻留在内质网腔中起到分子伴侣的作用外，还可以转运至细胞膜、细胞质，甚至分泌到细胞外，参与细胞分化、细胞生存、血管形成等重要生物学过程的调控，是一种多功能的蛋白质［2］。GRP78在正常成人脑、肺脏、心脏器官有基础水平的低表达［3］，在肿瘤组织中却高表达。有研究表明，GRP78与多种肿瘤的侵袭和转移相关。然而有关口腔鳞状细胞癌中GRP78的表达及其与肿瘤侵袭和转移相关基因表达关系的研究尚未见报道。本研究采用免疫组织化学方法检测口腔鳞状细胞癌组织中GRP78及肿瘤转移相关因子基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2和MMP-9蛋白的表达，采用逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）方法检测口腔鳞状细胞癌组织中GRP78的表达，阐明GRP78与口腔鳞状细胞癌发生、发展及转移的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

标本资料：26例口腔鳞状细胞癌石蜡标本和10例正常口腔组织石蜡标本。26例口腔鳞状细胞癌组织为2008年1月至2013年12月内蒙古林业总医院收治的口腔鳞状细胞癌患者的癌组织标本，10例正常口腔组织取自活检组织，组织切片均经病理学证实。其中男性26例，女性10例，年龄48～79岁，平均年龄63岁。26例口腔鳞状细胞癌组织标本按照肿瘤病理学分类标准进行诊断并分级：高分化10例，中分化8例，低分化8例。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学：组织标本常规10%甲醛固定，经梯度乙醇脱水，浸入二甲苯透明，常规浸蜡，包埋，切片，行免疫组织化学染色。兔抗人GRP78、MMP-2和MMP-9抗体购自中国BOSTER，羊抗兔辣根过氧化物酶标记的二抗和DAB显色剂购自美国Santa Cruz公司。RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒购自美国Promega公司。显微镜下观察口腔组织细胞质中GRP78、MMP-2和MMP-9的表达情况，根据细胞内棕染颗粒多少和染色的强弱，将表达强度分为不表达（-）、弱阳性表达（+）及强阳性表达（++）。判定方法如下：每张切片随机选取10个高倍视野。按着色面积百分数计分：0分，＜10%；1分，10%～40%；2分，40%～70%；3分，＞70%。按着色强度计分：0分，无着色；1分，淡黄色；2分，棕黄色。两者相乘：0分，为阴性（-）；1～3分，为弱阳性（+）；4分以上，为强阳性（++）。

1.2.2 RT-PCR：取液氮中保存的正常口腔组织和口腔鳞状细胞癌组织各50 mg，匀浆，按总RNA提取按试剂盒说明书操作，逆转录成cDNA，以cDNA为模板，分别用GRP78及GAPDH的引物进行PCR扩增，30个循环后取PCR产物进行电泳，采用天能凝胶成像系统拍照并分析条带灰度，实验重复3次。GAPDH引物序列如下：上游引物5′-GGTGATGCTGGTG CTGAGTATGT-3′，下游引物5′-AAGAATGGGAGTT GCTGTTGAAGTC-3′，扩增片段长度617 bp。GRP78引物序列如下：上游引物5′-GATAATCAACC AACTGTTAC-3′，下游引物5′-GTATCCTCTTCACCA GTTGG-3′，扩增片段长度578 bp。引物上海生工生物工程技术服务公司合成。

1.3 统计学分析

所有数据采用SPSS18.0软件进行统计学分析，口腔鳞状细胞癌组织与正常口腔组织GRP78和MMPs表达比较采用Fisher′s Exact检验，口腔鳞状细胞癌组织与正常口腔组织GRP78mRNA表达比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GRP78蛋白在口腔鳞状细胞癌组织和正常口腔组织中的表达

通过对36例口腔组织免疫组织化学染色结果分析，我们发现GRP78蛋白表达于细胞质中，呈淡黄色、棕黄色或棕褐色颗粒。GRP78蛋白在10例正常口腔组织中阳性表达率为20%（2/10），在26例口腔鳞状细胞癌组织中均成阳性表达，阳性表达率为100%（26/26），见图1。口腔鳞状细胞癌组织与正常口腔组织比较GRP78阳性表达率有统计学差异（P＜0.01）。

图1 正常口腔组织和口腔鳞状细胞癌组织中GRP78的表达×40Fig.1 Immunohistochemical analysis of GRP78 expression in normal oral tissue and oral squamous cell carcinoma tissues×40

2.2 不同病理分级的口腔鳞状细胞癌中GRP78的表达水平

口腔鳞状细胞癌病理分级为高分化的病例中GRP78强阳性表达率为30%（3/10），中分化病例为50%（4/8），低分化病例为87.5%（7/8）。各病理分级间GRP78强阳性表达率的差异有统计学意义（P＜0.05），提示GRP78的表达与口腔鳞状细胞癌的病理分级有关，其表达随着病理分级的增加而下降。

2.3 正常口腔组织和口腔鳞状细胞癌组织中GRP78mRNA的表达

RT-PCR结果显示，与正常口腔组织（0.33± 0.025）比较，高分化（0.68±0.017）、中分化（0.79± 0.026）、低分化（0.99±0.013）口腔鳞状细胞癌组织中GRP78mRNA表达量增加，差异有统计学意义（P＜0.01）；与高分化、中分化口腔鳞状细胞癌组织比较，低分化口腔鳞状细胞癌组织中GRP78mRNA表达量增加，差异有统计学意义（P＜0.01），见图2。

图2 半定量RT-PCR检测口腔鳞状细胞癌组织中GRP78 mRNA的表达水平Fig.2 Semi-quantitative RT-PCR analysis of GRP78 mRNA in normal oral tissue and oral squamous cell carcinoma tissue

2.4 肿瘤转移相关因子MMP-2蛋白在口腔鳞状细胞癌组织中的表达

通过对26例口腔鳞状细胞癌组织MMP-2蛋白免疫组织化学染色结果分析发现MMP-2蛋白表达于细胞质中，呈淡黄色、棕黄色或棕褐色颗粒。MMP-2蛋白在口腔鳞状细胞癌组织中均成阳性表达，阳性表达率为100%（26/26），见图3。

图3 口腔鳞状细胞癌组织中MMP-2的表达×40Fig.3 Immunohistochemical analysis of MMP-2 expression in oral squamous cell carcinoma tissues×40

2.5 肿瘤转移相关因子MMP-9蛋白在口腔鳞状细胞癌组织中的表达

通过对26例口腔鳞状细胞癌组织MMP-9蛋白免疫组织化学染色结果分析发现MMP-9蛋白表达于细胞质中，呈淡黄色、棕黄色或棕褐色颗粒。MMP-9蛋白在口腔鳞状细胞癌组织中均成阳性表达，阳性表达率为100%（26/26），见图4。

图4 口腔鳞状细胞癌组织中MMP-9的表达×40Fig.4 Immunohistochemical analysis of MMP-9 expression in oral squamous cell carcinoma tissues×40

3 讨论

越来越多的证据表明，展开或错误折叠的蛋白质在凋亡和癌变过程中发挥关键的作用［4］。分子伴侣蛋白GRP78是1977年在无葡萄糖介质中培养鸡胚成纤维细胞的过程中诱导产生的一种分子量为78 kDa的蛋白，又称免疫球蛋白重链结合蛋白，是热休克蛋白70家族中高度保守的成员之一，调节内质网的应激［5］。人类GRP78基因定位在9号染色体q33-q34.1上，主要在细胞质表达。在生理情况下，GRP78通过膜传感器维持灭活状态［6］。未折叠蛋白可使GRP78活化和触发未折叠蛋白反应，GRP78由生理性应激诱导产生［7］，在胚胎发育期间表达［8］。在细胞周期早期，GRP78在胚胎细胞增殖和保护内细胞团抵抗凋亡方面发挥重要作用［9］。GRP78过表达与多种人类肿瘤的侵袭相关，包括乳腺癌、肝癌、前列腺癌、结肠癌和胃癌等［10］。GRP78和肿瘤的转移相关表现在GRP78在肿瘤的转移细胞株和淋巴结转移的细胞株表达增加，敲除GRP78可以抑制肿瘤细胞的侵袭和肿瘤异种移植模型中肿瘤的生长和转移［11］。在乳腺癌、肝癌、前列腺癌、结肠癌和胃癌患者，GRP78表达增高与肿瘤病理级别、复发和患者生存质量相关［12］。有研究表明GRP78通过PTEN和Akt信号通路参与了癌症的发展和生存优势［13］。作为细胞膜蛋白的GRP78还通过MAPK/ PI3K和Smad2/3信号通路调节肿瘤细胞的增殖和侵袭［14］。

本研究采用免疫组织化学方法对口腔鳞状细胞癌组织和正常口腔组织中GRP78蛋白表达进行检测，结果表明了GRP78蛋白在口腔鳞状细胞癌组织中表达显著升高，其表达强度与口腔鳞状细胞癌的病理分级有关，随着肿瘤病理分级的增加而下降。GRP78mRNA表达在口腔鳞状细胞癌组织中的表达也显著高于正常口腔组织，且低分化的口腔鳞状细胞癌组织中GRP78mRNA表达高于中分化和高分化口腔鳞状细胞癌组织。肿瘤转移相关因子MMP-2和MMP-9蛋白在口腔鳞状细胞癌组织中表达均成阳性。上述结果表明了GRP78和肿瘤转移相关因子MMP-2和MMP-9蛋白在口腔鳞状细胞癌中均成阳性表达，提示GRP78蛋白可能在口腔鳞状细胞癌发生、发展及转移中发挥重要的作用。GRP78与口腔鳞状细胞癌发展的具体机制尚未明确，我们在后期研究中将进一步证实。

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（编辑 陈姜）

Expression of Glucose Regulated Protein 78 and Matrix Metalloproteinasesin OralSquamous CellCarcinoma

WANGBo1，JIKun2，ZHANGLi-yan2，SHANGDe-zhi3，HOUJun-yan4，HUAZheng-wei4
（1.Department of Pathology，The Second Clinical Medical School of Inner Mongolia University for the Nationalities，Molecular Pathological Research Institute of Inner Mongolia University for Nationalities，Department of Pathology，Inner Mongolia Forestry General Hospital，Yakeshi 022150，China；2.Department of Pathophysiology，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China；3.Department of Maxillofacial Surgery，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China；4.Grade 2011 OralMedicine，Shenyang MedicalCollege，Shenyang110034，China）

ObjectiveTo explore the expression and significance of glucose regulated protein 78（GRP78）and matrix metalloproteinases（MMPs）in human oralsquamous cellcarcinoma，and clarify the effectofGRP78in the process oforalsquamouscellcarcinoma.MethodsThe expression of GRP78，MMP-2 and MMP-9 were evaluated by immunohistochemistry in 26 oral squamous cell carcinoma tissues.RT-PCR was performed to detect the mRNA levels ofGRP78in oral squamous cell carcinoma tissues.ResultsThe results of immunohistochemistry indicated that the positive rates of GRP78 were 100%and 20%in oral squamous cell carcinoma tissues and normal oral tissues，and the difference was significant（P＜0.01）.Compared with well differentiated and moderately differentiated oral squamous cell carcinoma tissues，the positive rates of GRP78 protein in poorly differentiated oral squamous cell carcinoma tissues were obvious higher（P＜0.05）.Compared with normal oral tissues，the expression ofGRP78mRNA in oral squamous cell carcinoma tissues was significantly increased（P＜0.05）.Compared with well differentiated and moderately differentiated oral squamous cell carcinoma tissues，the expression ofGRP78mRNA in poorly differentiated was significantly increased（P＜0.05）. The positive expression of MMP-2 and MMP-9 were 100%in oral squamous cell carcinoma tissues.ConclusionThe expression ofGRP78and MMPs were obviously increased in oral squamous cell carcinoma tissue.The expression of GRP78 may plays an important role in the development and progression oforalsquamouscellcarcinoma.

oral squamous cell carcinoma；glucose regulated protein 78；matrix metallopreteinases

R739.8

A

0258-4646（2014）09-0786-04

国家自然科学基金（81260310）；辽宁省博士科研启动基金（20111126）

王波（1976-），男，副主任医师，博士.

汲坤，E-mail：jikun0629@gmail.com

2014-06-13

网络出版时间：