敦煌固本方对运动性疲劳小鼠肝组织自由基代谢及超微结构的影响*

杨雅丽，李希斌，陈 彻，楚惠媛，耿广琴，刘浩浩

(甘肃中医学院医学技术学院甘肃中医学院敦煌医学与转化教育部重点实验室，甘肃兰州730000)

随着现代竞技运动水平的不断提高，运动员在训练过程中出现过度训练的几率也越来越高。长期过度训练可引起机体肝组织自由基增多，进而造成肝细胞损伤，影响运动能力［1-2］。敦煌固本方由敦煌古医方《茯神汤》［3］加减化裁而来，全方补气养血、助阳益精，能全面提高机体运动功能。敦煌固本方组方合理，结构严谨，配方中所用药物未见含有运动员违禁成分的相关报道。笔者已经研究证实该方有抗疲劳的功效［4］，但其抗疲劳的作用机制尚不清楚。本研究通过建立小鼠游泳运动疲劳模型，探讨敦煌固本方对运动性疲劳小鼠肝组织自由基代谢及超微结构的影响，从而找寻该方消除运动性疲劳的作用机制，为该方应用于体育实践提供理论指导和实验依据。

1 材料与方法

1.1 动 物

健康雄性清洁级昆明种小鼠60 只，体质量为(20 ±2)g、由甘肃中医学院动物实验中心提供，合格证号为SCXK(甘)-2011 -0001。小鼠饲养环境温度(22 ± 2)℃，湿度(50 ± 10)%，自由摄食，饮水。

1.2 药品、试剂与仪器

敦煌固本方由人参、黄芪、白术、岷当归、陈皮、马鹿茸等组成，由甘肃中医学院附属医院中药房提供。将药材置于药量5 ～7 倍的蒸馏水中浸泡1 ～2 h，煮沸30 min，过滤，为1 煎;药渣加3 ～4 倍蒸馏水继续煮沸20 min，过滤，为2 煎;将1 煎和2 煎药液合并后，浓缩至37.5 mL，即配制成2 g 生药/ mL 溶液，备用。丙二醛(MDA)测试盒(批号20120317)、谷胱甘肽- 过氧化物酶(GSH-PX)测试盒(批号20120414)、超氧化物歧化酶(SOD)测试盒(批号20120413)、T-AOC 测试盒(批号20120320)、考马斯亮蓝测试盒(批号20120516)，均购自南京建成生物工程研究所;其余均为国产分析纯。BS224S 型电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司产品;XYJ80 -20型离心机，金坛市恒丰仪器厂产品;VIS -723N 型紫外可见分光光度计，北京瑞利分析仪器有限公司产品;DG3022 型酶联免疫检测仪，华东电子管厂产品;JEOL -1230 透射电子显微镜，日本电子公司产品。

1.3 动物分组与处理

购进小鼠后，先适应性喂养1 周，然后按照体质量随机分为6 组，分别为安静对照组(control，C)、安静给药组(experiment，E)、运动对照组(training control，TC)、运动给药组(training experiment，TE)，后两组又各分为力竭运动后即刻组和力竭运动后恢复24 h 组，即TC0、TC24、TE0、TE24。见表1。

表1 动物分组与处理

对照组每日灌胃生理盐水0.4 mL，给药组每日灌胃敦煌固本方0.4 mL，基础饲料饲养。运动组进行6 周的游泳训练，水温(30 ±2)℃，水深35 cm，于灌胃后1 h 开始运动，每周游6 d，每周一、周四称量体质量。第1 周游泳40 min/d，以后每周递加10 min，至第6 周游泳90 min/d。处死动物前称量其体质量，进行最后一次无负重的力竭性游泳，记录游泳时间。力竭判断的标准为:小鼠沉入水中超过10 s，且放在平面上无法完成翻正反射［5］。

力竭运动后运动组分为运动后即刻组和运动后恢复24 h 组，运动后即刻组在力竭运动后即刻处死，运动后恢复24 h 组于力竭运动后24 h 处死。

1.4 检测指标

各组小鼠处死后立即取出肝脏，用预冷的生理盐水洗净血污，滤纸吸干，然后用匀浆介质低温匀浆制备质量分数100 g/L 肝匀浆液，0 ～4 ℃下，5 000 r/min离心25 min，取上清液，-20 ℃保存，待测。同时，迅速取肝组织1 mm ×1 mm ×1 mm 左右大小分别放置磷酸缓冲液配制的体积分数3%戊二醛固定液中，进行电镜样品的前固定。

肝组织匀浆SOD、GSH-Px 活性、T-AOC、MDA含量的测定严格按照试剂盒说明书操作。透射电镜制样及观察:样品用体积分数3%戊二醛固定液固定2 h 以上，磷酸缓冲液漂洗3 次(10 min/次)，质量分数10 g/L 的锇酸固定1.5 h，磷酸缓冲液漂洗3 次(10 min/次)，500，700，800，900，1 000 g/L 乙醇梯度脱水(10 min/次)，1 000 g/L 丙酮脱水2 次(10 min/次)，1 000 g/L 丙酮与EPON-812 环氧树脂混合液浸透，EPON-812 环氧树脂包埋，35 ℃、45 ℃、65 ℃聚合，半薄切片，甲苯胺蓝染色，光镜下定位，超薄切片，枸橼酸铅和饱和醋酸铀双染，JEOL-1230 透射电子显微镜观察、拍照。

1.5 统计学方法

采用SPSS 13.0 统计分析软件处理。数据以均数(x-)±标准差(s)表示，进行单因素方差分析。以P ＜0.05 为差别有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠游泳至力竭时间对比

运动对照组小鼠游泳至力竭时间平均为(193.45 ±8.69)min，运动给药组小鼠游泳至力竭时间平均为(263.37 ±19.45)min，给药组小鼠游泳至力竭时间比对照组延长36.14%。

2.2 各组小鼠肝组织MDA、SOD、GSH-Px 和TAOC 活性对比

在安静状态下，给药组(E)与对照组(C)对比，肝组织MDA 含量降低，肝组织GSH-Px、SOD 活性和TAOC 升高，差别有统计学意义(P ＜0.05)。运动后即刻，小鼠肝组织MDA 含量、SOD、GSH-Px 和T-AOC 的活性都高于安静组，差别有统计学意义(P ＜0.05);TE0组与TC0组对比，小鼠肝组织MDA 含量下降，GSH-Px、SOD 和T-AOC 升高，差别有统计学意义(P ＜0.05)。运动后恢复24 h 组，大部分指标值有所下降，但仍没有恢复到安静时水平;TE24组小鼠肝组织SOD、GSH-Px 活性和T-AOC 恢复的程度、MDA 下降的程度均高于TC24组，差别有统计学意义(P ＜0.05)。见表2。

表2 各组小鼠肝组织MDA、SOD、GSH-Px 和T-AOC 活性对比 n=10±s

表2 各组小鼠肝组织MDA、SOD、GSH-Px 和T-AOC 活性对比 n=10±s

注:与C 组对比，* P ＜0.05;与TC0 组对比，# P ＜0.05;与TC24 组对比，△P ＜0.05。

组 别 MDA/(nmol·mgprot -1) SOD/(U·mgprot -1) GSH-Px/(U·mgprot -1) T-AOC/(U·mgprot -1)安静组 对照组(C) 7.11±0.17 89.82±1.33 536.62±22.50 6.65±0.15给药组(E) 6.75±0.08* 94.62±2.11* 649.35±24.21* 8.63±0.19*运动后即刻组 对照组(TC0) 14.22±0.15* 118.97±2.05* 736.41±29.80* 12.42±0.21*给药组(TE0) 12.71±0.21# 131.37±4.65# 854.09±27.11# 16.91±0.20#b运动后恢复24 h 组 对照组(TC24) 9.05±0.23* # 92.22±1.83# 661.65±28.29* # 11.33±0.38* #给药组(TE24) 8.40±0.12△ 115.88±2.16△ 780.12±36.97△ 14.57±0.23△

2.3 各组小鼠肝细胞超微结构对比

透射电子显微镜下:C 组、E 组肝细胞超微结构基本正常。TC0组超微结构损伤最重，以肝细胞细胞器肿胀、溶解、消失，以及肝血窦血管内皮细胞肿胀为主要超微结构改变。TE0组小鼠肝组织横切面的上述结构变化基本与TC0组相似，只是程度明显减轻。TC24组肝细胞超微结构损伤轻于TC0组，尤其是肝细胞胞质细胞器肿胀程度轻于TC0组。TE0与TE24相比后者超微结构损伤轻与前者，但未完全恢复正常水平。见图1。

图1 各组小鼠肝细胞超微结构(5 000 ×)

3 讨 论

根据运动性疲劳的相关症状，中医学可将其归于“虚劳”等范畴。中医学认为:该病多与脏腑功能失调有关;各种内外病因均可导致五脏功能失调，继而发为本病。中医学认为:“肝主藏血、主疏泄、主筋，肝气易于郁结，以条达为顺为贵”。《素问·痿论》曰:“肝主身之筋膜。”《黄帝内经·素问》指出:“动作劳甚谓之罢，肝主筋。”《类经·卷三》言:“人之运动，由乎筋力，运动过劳，筋必罢极。”现代医学认为:肝脏是体内重要贮血器官之一，与血液循环系统的功能有关。由于肝有贮藏血液精华和调节血量作用，所以人体脏腑组织(包括肌肉)各方面的活动，都与肝有密切关系。随着活动量增加，机体对血液的需要量也增加，并由肝为之调节。血液充盛，则经脉流通，筋骨强劲，关节活动灵活。此外，中医学认为，“久行伤筋”，而筋又主于肝。因此，长时间运动对肝脏会造成一定的影响。

自1978 年Dillard 将自由基理论引入运动医学以来，大量的研究和试验已经证实，高强度或长时间运动可导致人或动物的自由基代谢增强［6-7］。肝脏是机体物质代谢的重要器官，其中的自由基代谢及抗氧化酶变化较为明显。肝脏和骨骼肌线粒体呼吸链电子传递中电子漏形成的超氧自由基是运动性内源自由基的主要来源。氧自由基生成增多，脂质过氧化反应增强，构成了对细胞结构和功能的一系列损害。例如:细胞膜流动性、完整性和通透性的下降;线粒体结构和功能受损伤，继而影响电子的传递和偶联磷酸化的进行;电子漏引起质子漏，影响线粒体电子的传递和氧化磷酸化的进行等［8-9］。

MDA 是脂质过氧化的代谢产物，是造成细胞膜损伤的物质基础，其含量可以反映机体内脂质过氧化的程度，间接反映氧自由基对细胞的损伤程度。耐力运动后机体脂质过氧化较安静时加强，MDA 含量升高［10-11］。本实验结果与此一致。生物体内有产生自由基的体系，也有清除自由基的体系。目前研究得较为清楚的自由基清除体系有酶促与非酶促两个体系。酶促系统的酶存在于生物体内，是最有效、最专一的自由基清除体系，主要有GSH-PX和SOD。GSH-PX是体内催化H2O2分解的重要酶，它特异催化GSH 对H2O2的还原反应，而且可以使脂质过氧化物变成无毒的羟化物，从而起到保护细胞膜结构和功能完整的作用。SOD 则是机体直接清除自由基的抗氧化酶，可以分解H2O2和脂质过氧化物，阻断脂质过氧化反应，保护细胞免受损伤［12］。体内SOD、GSH-PX的协同作用可特异地清除运动过程中产生的过量自由基，有效地阻止脂质过氧化，保护肝脏组织免受过度损伤。在本实验中，灌服6 周敦煌固本方的小鼠肝组织的脂质过氧化水平明显下降，抗氧化酶SOD、GSH-PX活性显著升高，这可能是敦煌固本方抗疲劳的机制之一。

机体防御体系的抗氧化能力的强弱与健康程度存在着密切联系。影响防御体系的因素很多，如饥饿、碳水化合物供应不足、微量元素的吸收量、激素水平等，而过度疲劳也是一个重要的影响因素。抗氧化能力水平对反映机体的健康状况具有重要的意义。因此，本实验从这一角度出发，观察敦煌固本方对小鼠肝组织总抗氧化能力的影响。在本实验中，灌服敦煌固本方各组小鼠总抗氧化能力显著高于相应对照组，说明敦煌固本方在维护机体健康，提高机体的防御体系，进而防止运动对机体损伤方面有良好的效果。

本实验结果显示:力竭运动使自由基异常增多，引起肝组织超微结构的损伤，使线粒体、内质网等细胞器被过度消耗而溶解、断裂，糖原颗粒大量消耗，肝细胞出现空泡化。肝细胞超微结构的损伤在灌服敦煌固本方后明显减轻。运动恢复24 h 后，肝细胞超微结构的损伤有所恢复，但灌服敦煌固本方组小鼠恢复效果优于对照组。实验结果证明了敦煌固本方有抗自由基氧化功能，且对肝细胞线粒体、高尔基体等超微结构的损伤具有保护效果。电镜检查结果与生化检查结果可相互印证。

综上所述，敦煌固本方可显著提高小鼠运动能力，这与该方能提高肝组织抗自由基氧化的功能，同时，还对运动造成的肝组织超微结构的损伤有明显的保护作用有关。此为敦煌固本方的深度开发、利用提供了理论依据和实验支持。

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