针药结合对实验性脑缺血大鼠缺血区Bax、Bcl-2 的影响*

冯晓红，王 蕾，王秀云，张果忠

(1.天津中医药大学，天津300193 ; 2.天津武警医学院，天津300162)

脑血管病中脑梗死占大多数，其中大脑中动脉分布区的发病率最高。本课题组在前期工作中发现:井穴放血法可提高脑梗塞大鼠存活率及减小梗死面积［1-2］。为进一步探索针药结合对实验性脑缺血大鼠细胞凋亡的影响，笔者采用免疫组化法对脑缺血大鼠缺血区Bcl-2、Bax 的表达进行了观察，总结报道如下。

1 材料与方法

1.1 动 物

SPF 级健康成年雄性Wistar 大鼠，体质量220 ～250 g，由军事医学科学院卫生学环境医学研究所动物实验中心提供，许可证编号:SCXK -(军)2009 -003。

1.2 药 品

安宫牛黄丸，由北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂提供，批号1017031;尼莫地平，由天津市中央药业有限公司提供，批号110704。

1.3 永久性大脑中动脉栓塞模型的建立

参照Longa 法，并稍作改良:以质量分数100 g/L 的水合氯醛按350 ～400 μg/g 体质量腹腔麻醉;分离左侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉;颈总动脉近心端5-0 丝线结扎，颈内动脉处预置5 -0丝线扎活扣备用，在活扣的远心端用动脉夹夹闭颈总动脉;在颈总动脉距分叉部1 ～2 mm 处用眼科剪剪1 个小口，缓慢插入线栓(直径约为0.37 mm 鱼线，头端为钝头，用指甲油处理)，迅速去掉动脉夹并将活扣扎紧;缓慢插线栓，直到遇到阻力为止，插入深度距分叉处(18 ± 0. 5)mm，将活扣处结扎1 次;记录栓塞时间;再次结扎颈总动脉近心端，并固定线栓暴露部分，留鼠体内约3 mm，其余剪除;清理伤口，缝合后使用结晶磺胺于伤口处消毒、抗感染。

1.4 针刺选穴

选取手十二井穴。穴位定位:采用比较解剖学，参考人体相应穴位解剖标志，在大鼠前肢各趾的相应部位选取，即取位于大鼠双侧前肢趾端的少商、商阳、中冲、关冲、少冲、少泽，每侧6 个穴位，共12 个。

1.5 分组与处理

将大鼠随机分为正常对照组、假手术组、模型对照组和治疗组(分手十二井穴放血组、安宫牛黄丸组、针药结合组、尼莫地平组，各组又分为缺血6 h、24 h、48 h、72 h 4 个时间段)。除正常对照组、假手术组每组5 只动物外，其余每组10 只。

正常对照组:同样抓取，不进行任何处理。假手术组:分离一侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，缝合消毒。模型对照组:大鼠大脑中动脉栓塞造模，不予治疗。十二井穴放血组:用处理后的采血针于大鼠双侧前肢端的十二井穴点刺放血，出血量以血尽为止。安宫牛黄丸组:按0.25 g/kg 体质量灌胃给药。针药结合组:井穴放血+安宫牛黄丸灌胃。尼莫地平组:按0.1g/kg 体质量灌胃给药。井穴放血，每天放血2 次;药物灌胃，每天1 次。

1.6 检测指标

每组大鼠于各时间点分别灌注、取脑、制作石蜡切片，用免疫组化法检测Bax、Bcl-2 的表达。免疫组织化学染色法严格按照操作程序进行。采用Mias 图像处理系统，每只大鼠各取1 张免疫组化切片，在梗死灶周边区随机取5 个视野，对Bax、Bcl-2表达进行观察及分析。

1.7 统计学方法

2 结 果

各组大鼠脑组织Bax、Bcl-2 阳性细胞数及Bcl-2/Bax 对比结果见表1 ～3。①与模型对照组对比，缺血6 h，各组Bax、Bcl-2 阳性细胞数除尼莫地平组外，差别均有统计学意义(P ＜0.01)。从比值来看，针药结合组效果显著，井穴放血组和安宫牛黄丸组次之，但组间对比差别无统计学意义(P ＞0.05)。说明针药结合组在中风初期抑制细胞凋亡效果显著。②缺血24 h 时，与模型对照组对比，除尼莫地平组外，其他各组Bax 阳性细胞数明显减少，差别均有统计学意义(P ＜0.01);各组Bcl-2 阳性细胞与模型对照组对比，差别均有统计学意义(P ＜0.01)。从比值来看，针药结合效果最佳，井穴放血组次之。③缺血48 h 时，与模型对照组对比，其余各组Bcl-2阳性细胞数增多，差别均有统计学意义(P ＜0.01);Bax 阳性细胞数减少，只有假手术组和尼莫地平组差别有统计学意义(P ＜0.01)。从比值来看，针药结合组效果最佳，但与48 h 之前相比，比值下降，其余各治疗组对比，差异无统计学意义(P ＞0．05)。说明超出时间窗，针药结合治疗效果下降，抑制细胞凋亡能力减弱。④缺血72 h 时，与模型对照组对比，除安宫牛黄丸组外，其余各组Bax 阳性细胞数减少，差别均有统计学意义(P ＜0.01);假手术组Bcl-2 阳性细胞数减少，各治疗组增多，差别有统计学意义(P ＜0.01)。结果表明:从比值来看，中医药各治疗组与尼莫地平组对比，差别均无统计学意义(P ＞0．05)。说明在脑缺血48 h 之后，各种治疗手段效果都不显著，但仍优于模型对照组。

表1 各组大鼠脑组织Bax 阳性细胞数对比

表1 各组大鼠脑组织Bax 阳性细胞数对比

注:与同时段的模型对照组对比，* P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01;与同时段的针药结合组对比，# P ＜0.05，## P ＜0.01;与同时段的尼莫地平组对比，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。

组 别 动物数6 h 24 h 48 h 72 h正常对照组 5 0.60±0.84＊＊假手术组 5 0.80±1.03＊＊ 0.62±1.29＊＊ 0.39±0.25＊＊ 0.9±1.04＊＊模型对照组 10 42.30±2.87 40.60±3.34 40.00±3.27 41.80±4.42安宫牛黄丸组 10 34.80±4.32＊＊## 32.30±3.13＊＊#△△ 38.40±3.89 38.1±4.15* #井穴放血组 10 34.00±2.87＊＊##△ 34.00±1.76＊＊#△ 38.90±3.25 39.00±2.62#针药结合组 10 31.00±2.79＊＊△△ 31.20±5.16＊＊△△ 37.10±3.45 41.00±4.52尼莫地平组 10 40.80±3.26 40.60±4.17 39.0±4.22＊＊ 38. ±3.33＊＊

表2 各组大鼠脑组织Bcl-2 阳性细胞数对比

表2 各组大鼠脑组织Bcl-2 阳性细胞数对比

注:与同时段的模型对照组对比，* P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01;与同时段的针药结合组对比，# P ＜0.05，## P ＜0.01;与同时段的尼莫地平组对比，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。

组 别 动物数6 h 24 h 48 h 72 h正常对照组 5 1.70±0.95＊＊假手术组 5 1.60±1.17＊＊ 1.25±0.1＊＊ 0.69±1.91＊＊ 1.04±0.21＊＊模型对照组 10 19.30±4.35 13.70±3.40 16.40±3.86 17.00±2.58安宫牛黄丸组 10 23.80±3.71＊＊# 22.00±3.74＊＊## 25.0±2.83＊＊# 25.3±2.26＊＊井穴放血组 10 23.90±4.41＊＊# 23.90±3.38＊＊## 26.1±4.95＊＊#△ 24.9±4.18＊＊针药结合组 10 25.70±3.06＊＊△△ 26.00±4.08＊＊△△ 27.4±3.89＊＊ ＊＊△ 26.4±4.62＊＊尼莫地平组 10 21.20±3.29 21.80±3.08＊＊ 23.4±4.70＊＊ 25.1±2.51＊＊

表3 各组大鼠脑组织Bcl-2/Bax 对比

3 讨 论

目前认为:Bcl-2 表达是抑制凋亡的一个关键因素，可通过直接抑制线粒体对细胞色素C 的通透性增高，抑制Bid 和Bax 介导的细胞色素C 释放，间接抑制caspase 前体的激活，从而阻断细胞凋亡的发生。Bax 是和Bcl-2 类似的蛋白，但两者作用完全相反。当细胞受到死亡信号刺激后，Bax 发生构象变化，与抗凋亡蛋白发生相互作用，使线粒体膜通透性发生改变，释放细胞色素C，并与凋亡蛋白酶激活因子1 结合，顺序激活Caspase-9、Castpase-3，最终导致细胞凋亡［3］。高表达的Bcl-2 可使去除神经生长因子的交感神经元继续存活，而Bax 的过度表达则能对抗Bcl-2 对细胞凋亡的抑制作用。当Bcl-2 与Bax结合，形成Bcl-2/Bax 异二聚体时，可阻止Bax 插入线粒体外膜［4-5］，保护线粒体电势梯度，调节细胞内的自稳状态和氧化还原状态等，从多个方面抑制凋亡发生;但当Bcl-2 与Bax 的结合点断裂，则Bcl-2对细胞的保护性消失，说明Bcl-2 必须结合Bax 才能发挥其作用［6］。

脑缺血-再灌注后对脑的保护治疗能够恢复正常神经功能的缺血半暗带内神经组织的存活时间段常被称为脑的保护治疗“时间窗”［7］。本实验研究发现:大鼠海马区Bcl-2 表达于缺血后6 h 时明显增加，48 h 时达高峰，以后趋于平稳。Bcl-2 表达增加的时程和脑缺血耐受产生的时间窗基本吻合［8］，提示Bcl-2 表达增加可能是缺血后干预产生脑保护作用的重要机制。脑缺血早期Bcl-2 表达相对增强，随着脑缺血时间的延长，促凋亡蛋白Bax 的表达逐渐相对增强，神经细胞开始出现凋亡的形态学改变。Bcl-2 与Bax 的比值对决定细胞凋亡起关键作用，比值增大时促进细胞存活，反之则导致细胞死亡［9］。本实验中，安宫牛黄丸组和井穴放血组在脑缺血后6，24，48，72 h 4 个时段Bax、Bcl-2 比值无明显变化，但均高于模型对照组，且在6，24 h 时高于尼莫地平对照组;针药结合组在脑缺血后6，24 h Bcl-2、Bax比值最大，此表明:在脑缺血早期，安宫牛黄丸和井穴放血相结合治疗急性缺血性中风效果最佳，能有效地抑制细胞凋亡，但在缺血后48，72 h，尼莫地平对照组Bcl-2、Bax 比值超过了井穴放血组、安宫牛黄丸组和针药结合组，效果相对较好。可见超过时间窗后，传统中医疗法抑制细胞凋亡能力下降，正如古籍中描述安宫牛黄丸“无论阴闭、阳闭，唯需早用”，且安宫牛黄丸含有重金属，对大鼠的耐受水平也是一种考验，故安宫牛黄丸不宜久服。

此外，实验还发现:在缺血干预后变化幅度方面，Bax 表达较小，Bcl-2 却明显较大，两者比值增高。此现象意味着缺血后干预可能通过上调Bcl-2表达，减轻神经细胞凋亡，产生脑保护作用，而Bax在此过程中不起重要作用。此结果有待今后进一步验证。

［1］王秀云，刘公望，郭义，等.井穴刺络放血法对MCAO 模型大鼠大脑皮层HSP70 蛋白表达的影响［J］. 天津中医药，2005，22(6):477 -478.

［2］王秀云，刘公望，郭义，等. 手十二井穴刺络放血法对MCAO 模型大鼠大脑皮层c-fos 蛋白表达的影响［J］.上海针灸杂志，2004，23(12):39 -41.

［3］Li F，Fisher M. Animal modeling for developing stroke therapy［M］. Woburn:Butterworth-Heinemann，2001:83 -96.

［4］Davis M，Mendelow AD，Perry RH，et al. Experimental stroke and neuroprotection in the aging rat brain［J］.Stroke，1995，26 (6):1072 -1078.

［5］Shapira S，Sapir M，Wengier A，et al. Aging has a complex effect on a rat model of ischemic stroke［J］. Brain Res，2002，925(2):148 -158.

［6］Clarke DL，Johansson CB，Wilbertz J，et al. Generalized potential of adult neural stem cells［J］. Science，2000，288(5471):1660 -1663.

［7］Markgraf CG，Velayo NL，Johnson MP，et al. Six-hour window of opportunity for calpain inhibition in focal cerebral ischemia in rats editorial comment［J］. Stroke，1998，29(1):152 -158.

［8］王华梅，李军荣，吴家幂，等. 大鼠脑缺血再灌注后Caspase-3，Bcl-2 和Bax 的表达［J］. 神经疾病与神经卫生，2008，8(3):190 -192.

［9］Duverger D，MacKenzie ET. The quantification of cerebral infarction following focal ischemia in the rat:influence of strain，arterial pressure，blood glucose concentration and age［J］. J Cereb Blood Flow Metab，1988，8(4):449 -461.