pCDNA3.1-MT2A 真核表达载体的构建及亚细胞定位①

谭家余 陈敬林 黄 湘③ 李冬秀 袁春雷 万志丹

(南方医科大学附属中山市博爱医院中心ICU，中山 528403)

人金属硫蛋白(Metallothionein，MT)定位于16q13 上，是一类在生物界中普遍存在的，富含半胱氨酸、可结合7 个二价金属离子的多肽链，其分子量约为6 000～7 000 kD［1］。在哺乳类动物中，已发现四个MT 组分:MT-1、MT-2、MT-3 及MT-4。这些组分主要编码10 个有功能的亚型及7 个无功能的亚型［2，3］，其中MT-2A 是MT-Ⅱ亚型中唯一一个具有生物学作用的蛋白质［4］。本研究构建携带HIS 标签的真核表达载体pCDNA 3.1-MT2A，并将其转染至293T 和SMMC7721 细胞株，旨在对MT2A 在细胞内的表达和定位进行初步的研究。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 pcDNA3.1(+)质粒载体购自life 公司;293T 和SMMC7721 细胞株、anti-HIS 鼠抗、蛋白Marker、DH5α 菌株购自钟鼎生物;FITC 标记的羊抗鼠二抗购自Rockland 公司;DNA 胶纯化试剂盒、质粒小提取试剂盒购自AXYGEN 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 载体构建 使用基因合成的方法合成基因MT2A，在N 端添加了Kozak 序列及His 标签序列，扩增片段大小为216 bp，将扩增后的目的基因双酶切连接至pcDNA3.1(+)载体的BamH Ⅰ和Not Ⅰ之间。次日将全部的连接产物转化DH5α 菌株，挑取阳性克隆至液体培养基作震荡培养，碱裂解法小量提取和纯化质粒，用双酶切电泳后，进一步测序鉴定。

1.2.2 细胞准备 首先准备盖玻片，酸浸泡，用清水清洗干净，然后泡在75%的酒精，用时将盖玻片用酒精灯烧干，放入六孔板中;消化细胞，弃掉原有的培养基，加入2 ml 的PBS 冲洗一遍，弃掉，加入0.25%的胰酶消化至细胞变圆，弃掉，加入完全培养基吹打至细胞被吹散，移到盖玻片上，使得细胞密度为60%～70%。

1.2.3 质粒转染 取pCDNA3.1-MT2A-HIs 质粒1 μg 稀释到250 μl 的无血清培养基中，Lipo 2000 5 μl稀释到250 μl 的无血清培养基中，混匀，室温放置5 min，然后将稀释的质粒加入到Lipo 2000 中混匀，室温放置20 min，这期间将细胞用PBS 洗两遍后，加入1.5 ml 的无血清培养基。20 min 后将质粒与Lipo 2000 混合物滴入细胞中，放置37℃培养5 h，5 h换为完全培养基。

1.2.4 激光共聚焦定位 ①固定:细胞转染36 h后弃去原有培养基，PBS 洗两遍，加入1 ml 3.7%多聚甲醛，室温固定20 min;②透化:弃去多聚甲醛，PBS 洗三遍，加入1 ml 0.5% TritonX-100 4℃透化10 min;③封闭:弃去透化液，PBS 洗三遍，加入3%BSA 封闭液，37℃1～4 h;④一抗:将40 μl 配置好的一抗(anti-HIS 1∶800 稀释)滴到封口膜上，将盖玻片的细胞面盖到一抗上，避免产生气泡，然后放入湿盒中，4℃过夜;⑤二抗:一抗孵育完成后，将玻片重新放到6 孔板中，PBS 洗三遍，每次10 min，然后孵育二抗(FITC 标记的羊抗鼠二抗1∶25 标记)，方法同4;⑥染核:二抗孵育完成后，将玻片重新放到6孔板中，PBS 洗三遍，每次15 min，然后1∶2 000 稀释DAPI(4，6-二脒基-2-苯基吲哚)加入到6 孔板中，室温3 min，PBS 洗三遍，每次15 min;⑦封片:PBS配置10%甘油，滴至载玻片上，将盖玻片细胞面朝下放置到载玻片上，避免产生汽包，然后四周用指甲油封闭;⑧共聚焦显微镜观察:将做好的片子置于激光共聚焦显微镜下观察拍照。

2 结果

2.1 真核表达载体的鉴定 pCDNA3.1-MT2A-HIS重组质粒转化产物经质粒抽提，BamHI 和NotI 双酶切后产生约200 bp(MT2A 目的基因片段长度为216 bp)和5 500 bp［pCDNA3.1(+)空载体片段长度为5 428 bp］的两条条带，实验结果与预期目的片段大小一致(图1)。

2.2 阳性克隆测序及比对 挑取阳性克隆子测序，紫红色显示为设计的酶切位点，双划线区域为His-Tag 序列，单划线区域为MT2A 基因区域，插入片段的测序结果与MT2A 全长序列完全一致(图2)。阳性克隆子测序结果与设计的目的片段预期序列进行比对，100%匹配，截取部分比对序列如下(图3)。由图可见，经测序及比对鉴定，插入的目标片段完全正确。

图1 pCDNA3.1(+)-MT2A 质粒酶切产物凝胶电泳图Fig.1 Digestion products of pCDNA3.1(+)-MT2A plasmid of gel electrophoyresis

图2 pCDNA3.1(+)-MT2A 质粒插入片段的测序图Fig.2 Sequencing map of inserted fragment of pCDNA3.1-MT2A plasmid

图3 pCDNA3.1(+)-MT2A 质粒插入片段与预期序列的部分比对图Fig.3 Part of sequencing figure of inserted fragment of pCDNA3.1-MT2A that compared with expected sequencing figure

图4 MT2A 在293T 和SMCC7721 细胞中的定位(×100)Fig.4 Location of MT2A in 293T and SMCC7721 cell lines(×100)

2.3 激光共聚焦显微镜观察MT2A 在细胞中的定位 pCDNA3.1(+)-MT2A 真核表达载体转入293T 和SMCC7721 细胞系后，用激光共聚焦显微镜观察MT2A 在真核细胞内的定位。如图4 所示，图中蓝色荧光显示的为DAPI 染色的细胞核，绿色荧光显示的为MT2A 蛋白。由图可见，MT2A 主要表达于293T 和SMCC7721 细胞的胞质中，核内未见明显表达。

3 讨论

人MT2A 基因cDNA 序列全长共186 个碱基对，编码的MT2A 蛋白含62 个氨基酸，其中约三分之一的氨基酸是半胱氨酸，其巯基可以和金属离子可逆结合。研究发现MT-2A 不仅具有抗辐射、重金属解毒、清除自由基、修复组织损伤、调节微量元素平衡及抗衰老作用，还与细胞的增殖、凋亡、多种肿瘤的发生发展及肿瘤耐药密切相关［5-7］。大量的研究发现肿瘤组织中MT-2A 的高表达与肿瘤的恶性程度及浸润深度呈正相关。文献［7］综述报道:肺癌、鼻咽癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、白血病、食管癌、非霍奇金淋巴瘤中MT-2A 蛋白(或MT-2A mRNA)的表达均增加。也有文献报道，在肝癌和胃癌中，MT-2A 的表达降低［8-10］。最新的研究还发现MT-2A 基因多态性与波兰人群乳腺癌的发病风险有关［11］。

蛋白质的表达具有时间和空间特异性，大量研究显示同一种蛋白质在不同的细胞中有不同的表达，而同一种蛋白在细胞的不同部位表达，其功能也可能不同。因而阐明蛋白质在不同细胞或不同生理、病理状态下的表达定位情况将为其功能研究提供重要线索和理论依据。2003 年Moon 等［12］报道survivin 蛋白从细胞质转位到细胞核可能构成原发性肝癌细胞增殖和分化的重要调控机制。Solomon等［13］指出，maspin 蛋白在卵巢癌细胞的胞核内高表达比在胞质内高表达，其生存期要明显延长。Lonardo 等［14］在肺癌研究中也得到类似结论。

MT2A 蛋白在细胞内为胞质蛋白，主要存在于细胞质［15］。李新颖等［16］报道了人MT2A 蛋白在COS-7 细胞内呈斑点状分布且主要分布在细胞质中，核内未见明显表达。Zhou 等［17］研究MT 在化疗药物阿霉素中的解毒作用时发现，细胞质MT 可阻止阿霉素诱导的脂质过氧化和对相邻细胞器的破坏;细胞核的MT 可抑制阿霉素介导的DNA 损伤。

本研究以HIS 为标记物，构建携带HIS 标签的pCDNA3.1-MT2A 重组质粒的真核表达载体，分析MT2A 蛋白在293T 和SMCC7721 细胞株中的表达和定位情况。激光共聚焦显微镜观察显示，成功转染pCDNA3.1-MT2A-HIS 重组质粒的细胞内，可见到绿色荧光环绕于细胞核均匀分布于胞质中，核内未见明显表达。本研究证实了MT2A 在细胞内为胞质蛋白，其在正常细胞株(293T)和癌细胞株(SMCC7721)的定位相同，但并不是在所有细胞中均检测到MT2A 的表达，考虑可能是因为重组质粒转染效率以及细胞处于不同的发育周期而造成的差异。本研究为进一步探讨MT2A 在肝癌细胞内的功能奠定了基础。

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