类叶升麻苷通过诱导血红素加氧酶-1的表达抑制MPP+诱导的PC12细胞损伤

王洪权，王玉敏，崔其福，赵伟丽，成 龙

(赤峰学院医学院附属医院1.神经内科;2.肿瘤内科，内蒙古赤峰024005;3.中国医学科学院药用植物研究所药理毒理研究中心，北京100097)

氧化应激(oxidative stress，OS)损伤在帕金森病(Parkinson's disease，PD)的发病机制及其多巴胺能神经元死亡中发挥重要作用［1］。针对抗OS 的策略则成为PD 有效的治疗途径。

研究显示上调HO-1 的表达具有广泛的细胞保护作用。HO-1 在帕金森病中的作用引起了广大研究者的注意［2-3］。一些化合物通过诱导HO-1的表达可在帕金森疾病模型中发挥神经保护作用［4］。因此鉴定出具有诱导HO-1 表达的化合物成为目前国际的研究热点。类叶升麻苷(acteoside，AS)是一种糖苷类，具有神经保护活性，其可以抑制1-甲基-4-苯基吡啶(1-methyl-4-phenylpyridinium ion，MPP+)诱导的细胞损伤［5-6］，但其神经保护机制有待于进一步研究。本研究探讨AS 是否能够在PC12 细胞中上调HO-1 的表达，明确后者上调是否参与其对MPP+诱导损伤的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 试剂

类叶升麻苷(winherb medical technology Inc)，HO-1 抗体(#SPA895，Stressgen)，HO-1 抑制剂锌原卟啉ZnPP(SC-200329)和免疫印迹化学发光试剂(Santa cruz)，PVDF 膜(Millpore 公司)。MTT 和MPP+(Sigma 公司)。

1.2 细胞存活率的检测

MTT 法检测细胞活力，参照文献［7］。PC12 细胞(ATCC)接种在含5% 胎牛血清，10% 马血清，100U/ml 青霉素，100μg/mL 链霉素的DMEM 培养基中(pH7.2)，37℃，5% CO2 温育。

1.3 RT-PCR 检测HO-1 mRNA 表达

Trizol 提取总RNA。HO-1 和β-actin PCR 反应条件为:94 ℃2 min，94 ℃30 s，54 ℃30 s，和72 ℃45 s 共25 循环。根据文献设计合成引物，扩增出的片段大小为HO-1(322 bp)，β-actin(494 bp)。扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳，EB 染色，紫外下拍照记录。

1.4 蛋白免疫印迹法(Western blot)检测HO-1表达

依据参照文献［8］中方法。使用RIAP 缓冲液裂解细胞，用BCA 试剂测定蛋白含量，通过电泳缓冲液调整各组含量为5 μg /L，每个样本上样量为50 μg，在10%聚丙烯酞胺凝胶(SDS-PAGE)进行电泳后转移至PVDF 膜，预染蛋白标准分子质量确定蛋白分子质量标准位置。用含10%脱脂奶粉吐温盐缓冲液(TBS)液封闭，TBS 洗15 min×3;加入1 抗，4 ℃振荡孵育过夜，TBST 洗10 min×3;1∶10 000 加入辣根过氧化物酶标记相应的二抗，37 ℃振荡孵育1 h，TBS洗10 min×3;按ECL 试剂盒进行荧光显色反应。暗室中曝光，显影，定影。用分析软件Bio-Rad 分析每个条带的吸光度值，以目的蛋白丰度/β-actin 蛋白吸光度比值的均数±标准差来表示。以β 肌动蛋白作为内参照，计算待测蛋白条带积分吸光度与β 肌动蛋白的比值，表示待测蛋白的相对表达水平。

1.5 免疫荧光检测HO-1 在细胞内定位

参照文献中的方法［9］。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 类叶升麻苷抑制MPP+诱导的细胞存活率的下降

1 mmol/L MPP+作用PC12 细胞24 h 后，细胞存活率较对照组显著下降(P＜0.05)。AS(20 和30 μmol/L)预处理2 h 后，可明显抑制MPP+所导致的细胞存活率的下降(P＜0.05)(图1)。

2.2 类叶升麻苷在PC12 细胞中诱导HO-1 的表达

20 和30 μmol/L AS 可明显上调HO-1 mRNA(图2A，表1)。AS 可以诱导HO-1 蛋白的表达(图2B，表1)。

图1 类叶升麻苷对MPP +诱导的PC12 细胞存活率的影响Fig 1 The effect of acteoside on MPP + induced cell viability in PC12 cells(±s，n=3)

图2 类叶升麻苷诱导PC12 细胞HO-1 的表达Fig 2 Acteoside induces HO-1 expression in PC12 cells(±s，n=3)

表1 类叶升麻苷诱导PC12 细胞HO-1 的表达Table 1 Acteoside induces HO-1 expression in PC12 cells(±s，n=3)

表1 类叶升麻苷诱导PC12 细胞HO-1 的表达Table 1 Acteoside induces HO-1 expression in PC12 cells(±s，n=3)

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01 compared with control.

groupHO-1 mRNAHO-1 protein control100 ±18100 ±41 AS 1 μmol/L137 ±26163 ±70 AS 20 μmol/L226 ±48*322 ±67*AS 30 μmol/L339 ±73＊＊380 ±126＊＊

2.3 类叶升麻苷诱导HO-1 蛋白的表达位于胞质内

AS 可在PC12 细胞中诱导HO-1 的表达，而HO-1 的表达升高主要集中在胞质内(图3)。

图3 免疫荧光染色显示类叶升麻苷在PC12 细胞诱导HO-1 蛋白的表达Fig 3 Acteoside induces HO-1 protein expression in PC12 cells by immunochemical staining

2.4 类叶升麻苷通过上调HO-1 表达抑制MPP+诱导的细胞损伤

AS(30 μmol/L)预处理2 h 后，可明显抑制MPP+所导致的细胞存活率的下降(P＜0.05)(图4)，而HO-1 抑制剂ZnPP 可以减弱AS 对MPP+诱导细胞损伤的抑制作用(P＜0.05)(图4)。

图4 类叶升麻苷通过上调HO-1 表达抑制MPP +诱导的细胞损伤Fig 4 Acteoside protect against MPP + induced neurotoxicity by upregulating HO-1 expression(±s，n=12)

3 讨论

血红素加氧酶-1 (heme oxygenase-1，HO-1)是一个具有保护作用的在应激早期发挥反应的抗氧化酶蛋白，其参与游离血红素(Heme)降解的限速酶，其分子质量为32 ku，HO-1 催化血红素产生CO、胆绿素和游离铁［13］。大量研究表明，其细胞保护作用引起了广大研究者的注意［10-11］。HO-1 在PD 中具有神经保护作用［14］。最近研究显示，通过药理学途径上调HO-1 表达可抑MPP+引起的神经毒性损伤。虾青素(astaxanthin)可通过促进HO-1 的表达从而保护PC12 细胞受MPP+介导的NOX2 来源的ROS 氧化损伤［12］。1，2，3，4，6-O-五没食子酰葡萄糖通过PI3K 和ERK/Nrf2 通路促进HO-1 的表达从而保护PC12 细胞受MPP+介导的氧化损伤［4］。

类叶升麻苷具有神经保护活性。AS 在帕金森病模型中具有神经保护作用，AS 可通过抗氧化和抗凋亡机制抑制MPP+诱导的神经毒性损伤［5-6］。上调HO-1 表达在PD 具有神经保护作用。因此本研究以HO-1 为切入点，研究AS 的新的药理学作用。发现类叶升麻苷可在体外诱导HO-1 mRNA 和蛋白的表达，进一步免疫荧光染色显示类叶升麻苷可在PC12 细胞中诱导HO-1 的表达，而HO-1 的表达升高主要集中在胞质内。HO-1 抑制剂ZnPP 可以减弱类叶升麻苷对MPP+诱导细胞损伤的抑制作用，这表明HO-1 表达上调参与类叶升麻苷对MPP+诱导细胞损伤的抑制作用机制。

综上所述，本研究鉴定出类叶升麻苷为一个新的诱导HO-1 表达的新的化合物。本研究阐明了类叶升麻苷新的药理作用，即其可通过上调HO-1 的表达抑制MPP+诱导的神经毒性损伤。为进一步探讨其抑制氧化应激相关疾病的神经保护作用机制奠定了基础。

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