rHSG对COPD大鼠小气道阻力及成纤维细胞TGF-β1表达的影响

葛正行，周 洵，高 瑞，李 波

(贵阳中医学院第二附属医院呼吸内科，贵州贵阳550001)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases，COPD)是呼吸系统常见病，其重要病理特征气道重塑［1］，是COPD 气流不完全受限的主要原因。但其机制尚未完全阐明，治疗上亦缺乏有效的对策，是近年来COPD 研究的热点和前沿问题之一。

细胞增殖抑制基因(Hyperplasia Suppressor Gene，HSG)是温绍君等发现的一个新基因。研究发现HSG 可以有效地阻遏细胞周期和抑制细胞增殖［2］。2001年，在肺组织中也克隆出HSG。该基因的发现对认识和治疗各种细胞增殖性疾病分子机制开辟了一条新途径。目前，针对HSG 的研究主要集中在心血管疾病方面，而在COPD 气道重塑方面尚无相关研究。本研究试探索rHSG 在气道重塑中所发挥的作用及其调控的机制，为进一步深入干预COPD 气道重建机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料

脂多糖(LPS)和DMSO(Sigma 公司);黄果树香烟(焦油13 mg，尼古丁1.1 mg)(贵阳黄果树卷烟厂);ELISA 试剂盒(武汉博士德生物科技有限公司);0.25%胰蛋白酶(杭州吉诺公司);高糖培养基和优级胎牛血清(Hyclone 公司);胰蛋白酶粉剂(AMRESCO 公司);HSG 抗体和α-actin(Genway 公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分组和模型建立:清洁级，12 周，体质量50 g 左右雄性SD 大鼠［第三军医大学医学实验动物中心，许可证号:SCX(渝2007-0000)］，120只，于贵阳中医学院SPF 级实验动物中心饲养，按随机数字表法分为对照组(60 只)和COPD 组(60只)。采用熏香烟加气管注入LPS 法造模，给药方法参考文献［3］，对照组，1、14 d 经气管注入300 μL 0.9%氯化钠注射液。2 组大鼠于相同正常动物饲养环境饲养至80 d。

1.2.2 大鼠肺功能测定:随机选取对照组及模型组大鼠各15 只。将大鼠用2%戊巴比妥钠0.3 mL/100 g 体质量腹腔内麻醉后，仰卧位置于密闭体描箱内，其呼吸借助一端与插管连接，另一端与体描箱外动物呼吸机的皮管连接。动物呼吸时一个传感器受动物气道内压力的变化，另一个传感器感受体描箱内压力的变化并通过放大器转化为电信号，经电脑处理后计算出大鼠的肺顺应性(Cdyn)、气道阻力(RI)。

1.2.3 肺泡灌洗液中TGF-β1 的检测:随机选取对照组及模型组大鼠各30 只。取肺泡灌洗液用双抗体夹心(ABC-ELISA)法检测TGF-β1。

1.2.4 气道成纤维细胞的培养:取对照组及模型组大鼠各15 只，取肺组织切为约0.53～1 mm3的小块，于培养瓶中加入15%胎牛血清DMEM(高糖)培养基绝对静止培养。1 周后可见成纤维细胞长满并汇合成单层，用PBS 洗两遍后加0.25%胰蛋白酶1 mL 37 ℃消化2 min 后，加入2 mL 含15%胎牛血清高糖DMEM 培养基终止消化，1 000 r/min 离心5 min，以(2～3)×107/L 接种到培养瓶培养，用差时贴壁法提纯细胞。

1.2.5 Western blot 检测rHSG 在气道成纤维细胞中的表达:调整细胞浓度至3 ×105个/mL，收集蛋白，配制蛋白标准品，并绘制标准曲线，计算蛋白浓度。确保每孔上样量为30 μg。用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压120 V，时间2 h。随后用PVDF 膜转膜。转移条件230 mA 恒流，时间150 min。转膜完毕后用3%血清——TBS-T 封闭60 min。分别是使用HSG 抗体(1∶1 000)与α-actin(1∶3 000)，4 ℃，孵育12 h。用TBS-T 洗10 min，共洗3 次。再加二抗，与封闭液比例均为1∶2 000，室温孵育2 h。以TBST 洗10 min，共洗3 次。rHSG 于30、45 和1 min 分别压1 张;α-actin 压10 s。所得胶片结果扫入计算机用凝胶图像分析系统进行吸光度测定，随后计算出所需值。

1.2.6 RT-PCR 检测rHSG 基因在成纤维细胞中的表达:细胞分组处理同上，提取细胞中RNA。rHSG上游引物序列为:5'-GGAGCTGGACAGCTGGATTGA T-3'，下游引物序列为:5 '-AGCTCCAGCTGCTTGT CCATGA-3'，扩增片断长度609 bp。同时以扩增片断长度278 bp 的β-actin 作为内参照，β-actin 上游引物序列为:5'-CGTAAAGACCTCTATGCCAA-3'，下游引物序列为:5 '-GCTCAGTAACAGTCCGCCTA-3'。RT-PCR 反应条件为:48 ℃45 min，94 ℃2 min，1个循环;94 ℃30 s，61 ℃45 s，72 ℃80s，35 个循环;72 ℃最终延伸7 min 后终止反应。产物经1.5%琼脂糖凝胶水平电泳，EB 染色，凝胶成像仪照相，Quantity one4.3.1 凝胶分析系统对各电泳条带的亮度和面积进行分析，最后得出各条带总信(adjustVolume)，结果以rHSG/β-actin 的比值表示。

1.3 统计学分析

采用SPSS13.0 统计软件进行分析，所有数据均采用均值±标准差描述，各均数之间的比较采用单因方差分析(one-way AVOVA)，两两比较采用Neuman-Keuls 检验。

2 结果

2.1 动物造模一般情况

模型组大鼠早期出现躁动不安，精神萎靡、行动迟缓、纳少和毛发枯黄等症，随着时间推移出现咳嗽、气急、痰多和甚至喘鸣。后期出现体质量较对照组减轻;肺体积略增大，表面苍白不平;多数肺组织横截面可见焦油点散在分布。对照组饮食饮水良好，体型增大明显，皮毛光泽度好，活动能力强，精神状态良好。

2.2 大鼠肺功能及肺泡灌洗液中TGF-β1 的检测

模型组气道阻力(RI)明显高于对照组，而其肺顺应性(Cdyn)却明显下降(P＜0.05)。在模型组肺泡灌洗液中TGF-β1 含量明显高于对照组(P＜0.01)(表1)

表1 对照组与模型组肺功能和TGF-β1 比较Table 1 The comparison of lung function of TGF-β1 between the control group and model group

2.3 细胞培养及rHSG mRNA 和蛋白在其中的表达

2.3.1 气道成纤维细胞的培养:原代肺成纤维细胞培养7～12 d 即有新生成纤维细胞型贴壁生长。开始细胞形态多样化，但多为类圆形，带有粗大突起(图1A)，之后变为长梭形、条索状，继而汇合成片(图1B)，之后彼此连接成网状，分界较为模糊(图1C)。

图1 培养的气道成纤维细胞Fig 1 Trained of airway fibroblasts(×100)

2.3.2 两组成纤维细胞中rHSG mRNA 和蛋白表达的比较:模型组rHSG mRNA 和蛋白表达显著低于对照组(图2，图3;表2)。

图2 rHSG mRNA 在两组成纤维细胞中的表达Fig 2 rHSG mRNA expressed in two groups of fiber cells

图3 rHSG 蛋白在两组成纤维细胞中的表达Fig 3 rHSG protein expressed in two groups of fiber cells

2.4 rHSG mRNA 和蛋白与TGF-β1、肺功能RI、Cdyn 的相关性

运用线性回归分析rHSG mRNA 与TGF-β1 呈负相关(r= －0.42，P＜0.05)，与肺功能RI 呈负相关(r = －0.42，P＜0.05)，与Cdyn 呈正相关(r =0.37，P＜0.05)。

表2 rHSG mRNA 和蛋白在两组大鼠中表达比较Table 2 rHSG mRNA and protein expression inthe two groups of rats

rHSG 蛋白与TGF-β1 呈负相关(r = － 0.42，P＜0.05)，与RI 呈负相关(r = －0.42，P＜0.05)，与Cdyn 呈正相关(r=0.39，P＜0.05)。

3 讨论

气道重塑是COPD 病程发展的关键，主要是由于小气道周围纤维组织增生、管腔狭窄、塌陷，导致管壁僵硬，闭塞，最终导致阻塞性肺气肿、慢性肺心病，由此可以认为气道重建是成纤维细胞、平滑肌细胞增殖与凋亡失去平衡的结果。研究发现TGFβ1 在正常人、慢性支气管炎患者支气管黏膜活检标本中的表达较健康对照组显著增多，且TGF-β1 与成纤维细胞数量和基底膜明显相关，并发现能够合成TGF-β1 的还有嗜酸粒细胞和成纤维细胞［4］。可见TGF-β1 与成纤维细胞的相互作用在COPD 发生发展中扮演着重要的角色。而HSG 作为一种与参与细胞增殖与凋亡的基因，有可能参与了气道重塑中成纤维细胞与平滑肌细胞的增殖。

研究表明，rHSG 基因在对照组成纤维细胞中高表达，在模型组中低表达，说明其在COPD 大鼠模型气道成纤维细胞增生中有抑制增殖作用。结果显示，其与TGF-β1 呈负相关，与RI 成负相关，与Cdyn成正相关，说明rHSG 与气道气流受限关系密切，而且可能通过调控TGF-β1 来发挥其增殖抑制作用。进而证明了其在气道重塑中抑制增殖的作用。而rHSG 基因调控COPD 大鼠气道重塑的具体信号传导机制仍有待于进一步研究。

［1］李园.营养支持在慢性阻塞性肺疾病中的治疗疗效观察［J］.吉林医学，2011，32:23-24.

［2］温绍君，王佐广，陈光慧，等.HSG 基因单核苷酸多态性与原发性高血压的相关性研究［J］.中华预防医学杂志，2005，39:15-17.

［3］宋小莲，王昌惠，白冲脂多糖结合熏烟法和单纯熏烟法建立慢性阻塞性肺病大鼠模型的比较［J］.第二军医大学学报，2010，31:246-249.

［4］Polikepahad S，Moore RM，Venugopal CS.Endothelins and airways a short review［J］.Res Common Mol Pathol Pharmacot，2006，6:491-492.