慢性阻塞性肺病患者冷敏受体高表达及其临床意义

李敏超，李 娜，尤列·皮尔曼，维克多·科罗索夫，周向东*

(1.重庆医科大学附属第二医院呼吸内科，重庆400010;2.俄罗斯医学科学院远东呼吸生理与病理研究中心，俄罗斯布拉戈维申斯克675000)

冷空气刺激是慢性气道炎性疾病，如慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)和哮喘等疾病的重要急性加重因素［1］。此类患者常在轻微受凉或气候稍变化时表现急发加重，而后续细菌感染、炎性因子浸润及黏液分泌等事件使疾病呈现更复杂的病理改变［2-3］。从某种意义上讲，冷空气刺激对于此类疾病的触发或急性加重在一定程度上起着“扳机点”的作用［1］，故深入探究冷刺激作用于气道的受体机制及相关信号通路，对于此类疾病的防治有极重要的临床意义。瞬时受体电位蛋白-8(transient receptor potential protein-8，TRPM8)作为一种特异的冷刺激感应受体，是研究外周温度感受器对冷刺激反应的最佳候选靶目标［4-5］，本实验检测COPD 患者支气管黏膜上皮内是否有TRPM8 蛋白的高表达及人气道上皮细胞TRPM8 受体的基本特性。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及材料

兔抗TRPM8(C-term)多克隆抗体、非免疫源性正常兔IgG(Abgent 公司);兔SP Kit (SP9001)、DAB Kit (ZLI9018)(北京中杉金桥生物技术有限公司);小鼠抗β-actin 单克隆抗体、HRP 标记的羊抗兔或羊抗小鼠IgG(武汉博士德生物有限公司);PrimeScript RT reagent Kit 试剂盒、SYBR Premix EX TaqTM、DL2000 marker 和TriZol 试剂盒(TaKaRa Biotechnology 公司);TRPM8 引物(上海生工)。TRPM8通道特异性阻断剂BCTC、TRPM8shRNA 和对照shRNA(美国盐湖城犹他大学Christopher A.Reilly教授惠赠);正常人气道上皮16HBE 细胞(美国标准培养收集所ATCC);RPMI 1640 培养基、胎牛血清(Hyclone 公司);Fluo3-AM(北京碧云天生物技术研究所);脂质体2000(Invitrogen 公司)。

1.2 组织标本

收集因周围型肺癌于2008年10月至2010年10月在重庆医科大学附属第一医院胸外科行肺叶切除术患者的肺组织标本17 例(男13 例，女4例)，取材部位距离肿块4 cm 以上的上叶段支气管开口处黏膜组织，所取组织经HE 染色证实无癌性病变。所有患者均被告知研究项目内容并签字知情同意书。术前均未经放疗及化疗，均至少3月未曾使用氨茶碱、β 受体激动剂、激素及抗胆碱能受体药物。根据中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺病学组2007年制定的COPD 诊断标准分为COPD(轻至中度)组和对照组(无其他慢性气道炎性疾病)。COPD 组8 例，男6 例，女2 例，平均年龄58.1 ±6.3 岁(48～65 岁)，5 例为吸烟患者，吸烟量为44.8 ±10.5 包/年;对照组9 例，男7例，女2 例，平均年龄(61.1 ± 8.3)岁(52～72岁)，5 例为吸烟患者，吸烟量为(46.0 ±9.4)包/年。COPD 和对照组病例的年龄、性别、吸烟者所占比例及吸烟量均无明显差异。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化SP 法检测TRPM8 的表达:按参考文献［6］操作(兔抗TRPM8 多克隆抗体为1∶25 稀释，阴性对照则加入非免疫源性正常兔IgG)。

1.3.2 Real-time PCR 法检测支气管黏膜上皮TRPM8 mRNA 表达:按参考文献［7］操作。TRPM8(AF015521)的上游引物为5'-CAGCGCTGGAGGTG GATATTC-3'，下游引物为5'-CACACACAGTGGCTT GGACTC-3';GAPDH(NM_002046)的上游引物为5'-TGTTCGTCATGGGTGTGAACC-3'，下游引物为5'-C ATGAGTCCTTCCACGATACC-3'。

1.3.3 Western blot 法检测支气管黏膜上皮中TRPM8 蛋白表达:按参考文献［7］操作。兔抗TRPM8多克隆抗体浓度为1∶100，HRP 标记的羊抗兔或羊抗小鼠IgG 浓度稀释为1∶2 000。

1.3.4 细胞培养、分组和处理:16HBE 细胞接种于6 孔板中，置于37 ℃、5% CO2培养箱孵育，当细胞汇合达70%～80%时随机分为对照组:细胞于无胎牛血清、无双抗中37 ℃培养;冷刺激组:细胞于无血清培养液、18 ℃培养;冷刺激+BCTC 组:细胞于无血清培养液、终浓度BCTC 15 μmol/L 中18 ℃培养;冷刺激+TRPM8 shRNA 组:待细胞汇合至90%左右按照脂质体2000 说明书转染TRPM8 shRNA，转染后鉴定是否成功及转染效率，再于无血清培养液中18 ℃培养;冷刺激+对照shRNA 组:待细胞汇合至90%左右转染对照shRNA(操作同上)，再于无血清培养液中18 ℃培养。

1.3.5 MTT 法检测各组细胞活力:按参考文献［8］操作。

1.3.6 激光共聚焦测量不同条件下胞内［Ca2+］:浓度:按参考文献［8］操作，并记录细胞内6min 时［Ca2+］:浓度变化。

1.4 统计学分析

采用SPSS17.0 统计软件包分析，结果以均数±标准差(±s)表示，两两比较采用LSD 检验，非齐性资料用秩和检验;以黄色区域作为AOI，用Imagepro-plus 6.0 软件进行图像分析。

2 结果

2.1 TRPM8 蛋白在支气管黏膜上皮内的表达

TRPM8 阳性染色细胞位于支气管黏膜上皮内，TRPM8 蛋白主要分布于支气管黏膜上皮基底细胞或小颗粒细胞的细胞膜，部分分布于柱状上皮细胞或杯状细胞的胞质(尤其是靠近管腔一侧)及细胞膜(图1A、1B)。阴性对照组无阳性显色(图1C)。COPD 组的支气管黏膜上皮IA/area 值显著高于对照组(P＜0.05)(表1)。

图1 COPD 组与对照组气道上皮TRPM8 蛋白表达水平的比较Fig 1 The comparison of TRPM8 protein expression in bronchial epithelium from control and COPD group(×400)

2.2 TRPM8 mRNA 及TRPM8 protein 的表达

COPD 组支气管黏膜内TRPM8 mRNA 及TRPM8蛋白相对表达量显著高于对照组(P＜0.01)(表1)。

表1 COPD 组及对照组支气管黏膜上皮TRPM8 的表达Table 1 TRPM8 expression in human bronchial epithelium of subjects with COPD and control group (±s，n=17)

表1 COPD 组及对照组支气管黏膜上皮TRPM8 的表达Table 1 TRPM8 expression in human bronchial epithelium of subjects with COPD and control group (±s，n=17)

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01 compared with control.

group(n)TRPM8 protein immunohistochemistry Western blot TRPM8 mRNA control(9)0.19 ±0.040.67 ±0.081.00 ±0.00 COPD(8)0.24 ±0.05*0.75 ±0.06*3.13 ±0.39＊＊

2.3 细胞活力测定结果

各组细胞在同一时间点吸光度值差异无明显统计学意义(表2)。

2.4 冷刺激、BCTC 和TRPM8shRNA 转染对16HBE 胞内［Ca2+］:浓度影响

冷刺激6min 时［Ca2+］:浓度较对照组明显升高(P＜0.05)。冷刺激+ BCTC 组及冷刺激+TRPM8 shRNA 组均较冷刺激组明显下降(P＜0.05)。转染shRNA 对照组值对冷刺激引起的［Ca2+］:浓度无明显抑制作用(表3)。

表2 各组细胞在不同时间点增殖活力的比较Table 2 The comparison of each cell proliferation activity at different time points(±s，A value，n=5)

表2 各组细胞在不同时间点增殖活力的比较Table 2 The comparison of each cell proliferation activity at different time points(±s，A value，n=5)

group8 hours16 hours24 hours36 hours 37 ℃0.23 ±0.040.37 ±0.030.52 ±0.030.71 ±0.05 18 ℃0.20 ±0.030.37 ±0.030.52 ±0.040.68 ±0.05 18 ℃+BCTC 15μm0.19 ±0.040.35 ±0.030.48 ±0.040.71 ±0.05 18 ℃+TRPM8 shRNA0.19 ±0.040.34 ±0.040.49 ±0.040.66 ±0.06 18 ℃+scramble shRNA0.02 ±0.030.34 ±0.020.50±0.030.68 ±0.05

表3 BCTC 及TRPM8 shRNA 对18 ℃刺激细胞6 min 时胞内［Ca2+］:的抑制作用Table 2 The effect of BCTC and TRPM8 shRNA on［Ca2+］i after exposure to 18 ℃for 6 min(±s，n=5)

表3 BCTC 及TRPM8 shRNA 对18 ℃刺激细胞6 min 时胞内［Ca2+］:的抑制作用Table 2 The effect of BCTC and TRPM8 shRNA on［Ca2+］i after exposure to 18 ℃for 6 min(±s，n=5)

#P＜0.05 compared with 37 ℃group;*P＜0.05 compared with 18 ℃group.

groupfluorescence intensity 37 ℃1.01 ±0.02 18 ℃5.02 ±0.36#18 ℃+BCTC 15 μm1.18 ±0.20*18 ℃+TRPM8 shRNA1.02 ±0.18*18 ℃+scramble shRNA4.40 ±0.10*

3 讨论

COPD 的急性发作是导致其高病死率的重要原因，其急性发作的诱因及机制尚不完全清楚。其中寒冷是加重患者症状和诱发其发作的重大因素，反复冷空气刺激与高死亡率密切相关［2］。研究发现，细胞膜上存在一类跨膜通道蛋白-瞬时型感受器电位蛋白(transient receptor potential，TRP)，其亚型TRPM8 蛋白为一种冷激活的温度感觉通道，能被冷刺激和左旋薄荷醇、桉叶脑等冷却剂激活［4-5，9］，导致细胞因子及趋化因子的产生［10-11］。

TRPM8 是存在于细胞质膜或细胞器膜上的冷敏感通道，是机体感受外界冷刺激的重要受体，在神经组织及非神经组织中均有广泛表达，但其确切表达方式和组织分布仍不是很清楚［11-14］。作为内脏的支气管肺系统受到表达TRPM8 受体的迷走传入神经支配，可引起植物神经反射，增加气道阻力另有报道［15］。对于TRPM8 受体在寒冷所诱发的呼吸道疾病中所起的作用，目前仅局限于对人肺气道上皮细胞及肺内迷走传入神经的初步研究。

本实验发现，TRPM8 阳性染色细胞位于支气管黏膜上皮内，TRPM8 蛋白主要位于支气管黏膜上皮基底细胞或小颗粒细胞的细胞膜，部分分布于柱状上皮细胞或杯状细胞的细胞膜及胞质，尤其是靠近管腔一侧。COPD 组的支气管黏膜上皮内TRPM8蛋白表达量、TRPM8 mRNA 均显著高于对照组。提示COPD 患者支气管黏膜上皮存在TRPM8 通道蛋白的高表达。冷刺激可诱导16HBE 胞内［Ca2+］浓度迅速升高，BCTC、TRPM8 shRNA 转染可阻断冷刺激诱导的胞内Ca2+浓度升高，故证明TRPM8 是一个可被低温激活的特异性冷敏感受体，呼吸道黏膜上皮内的TRPM8 受体可感知冷空气从而诱导一系列病理生理改变。在有基础炎性反应的气道中，TRPM8 蛋白呈现出高表达状态及Ca2+水平升高，在一定程度上能解释为何在受到冷空气影响时，COPD等慢性气道炎性反应患者比正常人更易出现急性加重，其机制还有待进一步明确。在国内首次证实了COPD 患者支气管黏膜上皮TRPM8 受体的高表达，这为吸入冷空气诱发的气道炎性反应及哮喘机制提供了一个新的研究视角。

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