系统性红斑狼疮患者血清乳铁蛋白的分析

马友楠，高瑞通，吴凤岐，高凤英，张 伟*

(1.中国医学科学院基础医学研究所免疫系，北京100005;2.中国医学科学院北京协和医院肾内科，北京100730;3.首都儿科研究所风湿免疫科，北京100020;4.三河市儿童医院内科，河北廊坊101601)

乳铁蛋白(lactoferrin，LF)是转铁蛋白家族中的一员，广泛存在于各种分泌液及中性粒细胞的次级颗粒中［1］。LF 不仅参与铁的转运，还能调控细胞的生长和分化，具有抗炎活性，抑制肿瘤的发生及迁移等种种功能［2-4］。LF 在体液中的含量与中性粒细胞数目密切相关［5］，而大多数系统性红斑狼疮患者(systemic lupus erythematosus，SLE)患有中性粒细胞减少症［6］。但关于LF 和自身免疫疾病之间的相互关系研究不多，且LF 与许多免疫细胞间的相互作用机制尚不明确。因此，本研究着重研究LF 在SLE 患者外周血中的含量变化及其影响因素。

1 材料与方法

1.1 病例资料

儿童SLE 患者的样本及资料收集于2001年至2012年，来自北京首都儿科研究所风湿免疫科，共38 例，男性7 例，女性31 例，平均年龄(10.3 ±2.6)岁，年龄范围在2～18 岁之间。成人SLE 患者的样本和资料收集于2012年，来自于北京协和医院肾内科，共46 例，男性5 例，女性41 例，平均年龄(31.9 ±11.5)岁，年龄范围在18～50 岁之间。所有SLE 患者的症状都符合由美国风湿学会所制订的分类标准［7］中的至少4 项。健康儿童和健康成人样本及资料来自于常规体检人群且在样本收集时未发现有风湿病及其他疾病。IgA 肾病患者的样本及资料来自于北京协和医院肾内科，共29 例，男性15 例，女性14 例，平均年龄(29.3 ±6.2)岁，年龄范围在17～40 岁之间，所有患者经肾脏穿刺活检确诊为IgA 肾病。其他肾病患者样本及资料来自北京协和医院肾内科，经肾活检确诊为非IgA 肾病，包括紫癜性肾炎4 例、新月体性肾炎3 例、缺血性肾损伤2例、膜性肾炎8 例和恶性高血压肾损伤2 例，共19例，男性11 例，女性8 例，平均年龄(34.2 ±11.9)岁，年龄范围在13～51 岁之间。

1.2 主要试剂

BCA 蛋白定量试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司)，牛血清白蛋白(北京元亨圣马生物技术研究所)，2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐ABTS(Amresco 公司)，Tween-20(Fluka 公司)。小鼠抗人乳铁蛋白抗体KT14 和HRP 标记的小鼠抗人乳铁蛋白抗体KT12(均购自北京爱博生公司)。

1.3 主要方法

1.3.1 ELISA 检测血清乳铁蛋白含量:酶标板中包被KT14，用包被液稀释至2 mg/L，100 μL/孔，4 ℃过夜。含0.05% Tween-20 的磷酸盐缓冲液(PBST)洗板4 次，加入含2%牛血清白蛋白(BSA)的PBST 封闭液200 μL/孔，室温封闭2 h。用封闭液以1∶100 稀释血清样本，100 μL/孔，室温孵育1 h。PBST 洗板4 次，用PBST 以1∶1000 稀释KT12，100 μL/孔，室温孵育1 h。PBST 洗板4 次，每孔加入100 μL ABTS 显色液，室温避光显色30 min，测定405 nm 波长下吸收值。

1.3.2 BCA 试剂盒检测血清中总蛋白含量:用BSA(试剂盒自带，浓度2 g/L)做标准曲线，浓度梯度为:1.6、0.8、0.4、0.2 和0.1 g/L，用PBS 以1∶100稀释待测样本，每孔中加25 μL 待测样品或BSA 标准品。以50∶1 比例混合A 液和B 液，200 μL/孔，37 ℃孵育30 min。测定562 nm 波长下吸收值。根据BSA 标准品计算出样品蛋白浓度。

1.4 统计学分析

采用GraphPad Prism(Version 5.01)软件进行分析。符合正态分布的数据中，非配对t 检验用于两组间差别分析，配对t 检验用于组内差别分析。Mann-Whitney 检验用于非正态数据的分析。Spearman's 检验用于计算非正态分布数据间的相关性。

2 结果

2.1 SLE 患者血清LF 的含量显著低于健康对照

儿童及成人SLE 患者血清LF 的水平均显著低于性别和年龄匹配的健康儿童及成人(图1)。

2.2 SLE 患者血清中LF 含量的降低与血清中总蛋白水平无关

SLE 患者与健康人血清总蛋白的水平无显著差别，且血清LF 的水平与总蛋白水平不存在相关性(图2)。

2.3 SLE 患者血清中LF 水平的降低与肾损伤无关

IgA 肾病(IgA nephropathy，IgAN)及其他肾病患者(disease control，DC)血清LF 水平低于健康人(P＜0.05)，IgAN 与DC 两组间无差异，但健康人、IgAN 及DC 患者血清LF 水平均显著高于SLE 患者(P＜0.001)(图3A)。并且，四组间血清中总蛋白含量无差异(图3B)。IgAN(图3C)及DC(图3D)血清中LF 与总蛋白水平同样不存在相关性。

图1 SLE 患者与健康人血清中LF 水平的比较Fig 1 Comparison of LF levels in SLE patients and healthy subjects

图2 血清中总蛋白与LF 的相关性Fig 2 Correlations between serum LF levels and total protein

2.4 血清LF 水平随年龄增长变化的趋势分析

1 岁至50 岁健康人血清LF 的水平基本一致，51 岁至80 岁健康人血清中LF 水平有所降低(P＜0.05)(图4A)。1 岁至50 岁健康男性血清LF 的水平略高于女性，但不具有显著差异(图4B)。50 岁至80 岁健康男性和女性间LF 的水平基本一致(图4C)。

3 讨论

SLE 是一种复杂疾病，患者免疫系统紊乱，导致自身抗体的产生，同时机体发生多种异常变化，最终导致各种病理性后果。部分SLE 患者伴有肾损伤，肾损伤的标志是蛋白尿、尿沉渣异常，影像学检查变化或某些综合征时特殊的血尿成份异常。

图3 SLE 患者和其他肾病患者血清LF 水平的分析Fig 3 LF levels in SLE patients and patients with renal diseases

图4 血清中LF 含量与年龄和性别之间的关系Fig 4 Variations of LF levels with different age and gender

本实验检测了健康人及SLE 患者血清LF 的含量。结果显示，SLE 患者血清LF 水平均显著低于性别和年龄匹配的健康人。进一步研究发现SLE 患者血清中LF 水平的降低并不是总蛋白的变化引起的，与肾损伤也无直接关系，那么患者LF 降低的原因可能为其合成量过少或消耗过多。LF 在血液中含量与中性粒细胞数目密切相关［5］，由于很多SLE患者存在中性粒细胞减少情况［6］，推测中性粒细胞的减少可能导致患者LF 合成量降低。已有报道表明SLE 患者存在抗LF 的自身抗体［8］，这些自身抗体可能与LF 结合形成免疫复合物被机体吞噬细胞吞噬清除，导致LF 水平下降。另外，SLE 患者中性粒细胞激活后脱颗粒并释放NETs［9］。次级颗粒中所含的LF 将吸附到NETs 上，而不是以游离状态释放到血中，这也可能是患者血清LF 水平较低的原因之一。

LF 在机体抗感染方面发挥作用，推测其水平降低将对抗感染不利。SLE 患者普遍存在易感染情况，其LF 水平较低可能是原因之一。除此之外，本研究发现50 岁以上健康人血清LF 含量也较低。推测这将影响老年人机体抗感染能力，但LF 的降低是否与该人群较易得SLE 有关需进一步研究。

综上，LF 在SLE 患者血清中水平显著降低，为检测SLE 疾病提供了一种可能的生物标志物。但其降低原因并不明了，还需进一步研究证明，本研究只是排除了总蛋白和肾损伤两个因素的影响。利用SLE 小鼠模型进一步研究LF 与SLE 疾病间的关系，探讨LF 的降低是否与其易得SLE 有关。

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