急性出血坏死性胰腺炎大鼠循环内皮细胞与胰腺病理损伤的关系

张保刚，王晓晔，崔华雷

急性出血坏死性胰腺炎大鼠循环内皮细胞与胰腺病理损伤的关系

张保刚1，王晓晔2，崔华雷2

目的：探讨急性出血坏死性胰腺炎大鼠循环内皮细胞、血清淀粉酶与胰腺病理损伤的关系。方法：采用胆胰管逆行注射5%牛磺胆酸钠制备急性出血坏死性胰腺炎的大鼠模型，于造模成功后3 h、6 h、12 h处死并取血，用流式细胞仪检测循环内皮细胞，用全自动生化分析仪检测查淀粉酶活性，取胰腺病理评分，进行血淀粉酶与病理评分、脱落细胞与病理评分之间的相关性分析。结果：造模成功后3 h血清淀粉酶为（5431.3±758.5）U/L，病理评分为3.3±0.8，脱落细胞计数为（35.4± 3.1）%；6 h血清淀粉酶为（6450.5±669.8）U/L，病理评分为4.7±0.8，脱落细胞计数为（43.3±2.7）%；12 h血清淀粉酶为（7934.2± 667.9）U/L，病理评分，6.3±0.9，脱落细胞计数为（54.8±3.8）%。血清淀粉酶与病理损伤评分之间的相关系数r=0.351，P＜0.01，关系式为Y=292.7X+5098，循环内皮细胞与病理损伤评分的相关系数r=0.842，P＜0.01，关系方程为Y=21.227+4.837X。结论：血清淀粉酶及血循环内脱落内皮细胞数量与急性出血坏死性胰腺炎时机体的损伤程度均呈正相关，但后者的相关性更强，更能反映多脏器损伤的程度。

脱落细胞；淀粉酶水平；病理分型；相关性

近年来儿童急性重症胰腺炎发病率逐年上升，因儿童具有年龄、体重、发育程度等方面的特殊性，治疗方法、用药剂量与成人有所不同。全身炎症反应综合征引起血管内皮细胞坏死，并脱落入血循环，可以通过流式细胞仪进行检测[1-2]。脱落的细胞越多，血管内皮受到损伤越重。因此，除血胰淀粉酶外，可通过分析血管内皮细胞脱落情况间接了解胰腺及受波及器官损害程度。本研究旨在通过复制大鼠模型，探讨血循环内皮细胞（circulating endothelial cells，CEC），淀粉酶与胰腺病理损伤的关系，找到临床化验指标与疾病程度之间的量化关系，推断个体化用药的可能。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级SD大鼠90只，雄性，体质量230～250 g，周龄16～18周的SD大鼠，这个生存期的大鼠正处于成年前期，各器官功能逐渐成熟，与儿童的生理功能相似。用这个周龄的大鼠能较准确的复制儿童出血坏死性胰腺炎的病理过程。大鼠由北京大学医学部实验动物科学部提供（许可证号：SCXK（京）2011-0012），大鼠于实验前在天津市儿童医院外科实验室适应性饲养1周，普通饲料喂养，自由饮水，饲养温度22℃～25℃，相对湿度40%～60%。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。

1.1.2 主要试剂 5%牛磺胆酸钠，10%水合氯醛。

1.2 实验方法

1.2.1 模型制备和处理 查随机数字表法将90只SD雄性大鼠，随机分为：假手术组（SO组）和模型组（SAP组），每组45只，再随机分为3 h、6 h、12 h共3个时间点组，每时间点组15只，于各个时间点处死相应大鼠并收集标本。术前大鼠禁食12 h，自由饮水。SAP组用10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠[3]，固定于手术台，安尔碘消毒腹部三遍，行上腹部剑突下正中切口（1～2 cm）、进腹，提起十二指肠，辨认胰胆管及肝门部胆总管，用动脉夹夹闭胆总管近肝门处，于十二指肠降部找到胰胆管开口，用静脉留置针在对侧肠壁上选一无血管区进针，找到并进入十二指肠大乳头，缓慢推进4～5 mm，确定针头在胰胆管内后，拔出针芯，轻压十二指肠大乳头，注入5%牛磺胆酸钠（0.1 mL/100 g，0.2 mL/min）[4]，注射完毕后用手压迫进针处3 min。去除动脉夹，将肠管复位，分层关腹。SO组仅找到十二指肠及胰腺翻动几次后关腹。实验大鼠手术后均禁食禁饮，背部皮下注射生理盐水补液(40 mL/kg体质量)[5]。

1.2.2 血清淀粉酶检测 两组于造模成功后3 h、6 h、12 h各取相应组大鼠，用10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠至相关时间点，经大鼠股静脉取血2～3 mL（3000 r/min，离心8 min），用全自动生化分析仪检测大鼠血清淀粉酶。

1.2.3 流式细胞术 经股静脉取血1 mL置于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中，用于流式细胞仪检测脱落血管内皮细胞数。流式细胞仪Cellquest获取及分析数据。根据前向散射光(FSC)及侧向散射光(SSC)设门将目的细胞与血小板及细胞碎片分开，每例标本收集20 000个细胞。根据阴性对照设定CD31阳性界限，检测目的细胞群内CD31阳性细胞的百分比。选取有代表性的CD31高表达及低表达模式图。

1.2.4 胰腺病变观察及组织病理学观察评分 取胰腺组织，10%福尔马林固定，常规石蜡包埋切片，行苏木精-伊红（HE）染色。分别用低倍镜（100倍）和高倍镜（200倍）观察，每个器官取2张切片，每张切片随机取5个视野。胰腺病理学评分参照Schmidt[6]评分。由两名病理专业医师行双盲法按标准评分。1.3 统计学处理 各项指标使用单变量重复测量方差分析进行计算，SPSS 13.0统计软件进行方差齐性检验，取P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 淀粉酶变化 SAP组大鼠术后3 h、6 h、12 h血清淀粉酶水平均高于SO组，差异有统计学意义（P＜0.01），见表1。SAP组血淀粉酶水平在术后出现逐渐升高的趋势。

表1 两组大鼠血清淀粉酶水平变化（±s，U/L）

表1 两组大鼠血清淀粉酶水平变化（±s，U/L）

注：与SO组比较，aP＜0.01

组别SO组SAP组3 h 6 h 12 h n 15 13淀粉酶1572.3±114.9 5431.3±758.5an 15 12淀粉酶1737.94±91.1 6450.5±669.8an 15 11淀粉酶1683.21±104.7 7934.2±667.9a

2.2 胰腺病理评分 SAP组大鼠术后3 h、6 h、12 h胰腺病理评分与SO组大鼠相比显著增高，差异有统计学意义，P＜0.01。见表2。病理变化见图1。

表2 两组大鼠胰腺病理Schmidt评分（±s）

表2 两组大鼠胰腺病理Schmidt评分（±s）

注：与SO组比较，aP＜0.01

组别SO组SAP组3 h 6 h 12 h n 15 13 Schmidt评分0.3±0.1 3.3±0.8an 15 12 Schmidt评分0.5±0.1 4.7±0.8an 15 11 Schmidt评分0.7±0.2 6.3±0.9a

图1 胰腺组织病理变化（HE×200）

2.3 循环内皮细胞相对计数 SAP组大鼠术后3 h、6 h、12 h静脉血血管内皮细胞相对数与SO组对比明显增高，差异有统计学意义（P＜0.01），见表3。

表3 两组大鼠脱落血管内皮细胞相对计数（±s，100%）

表3 两组大鼠脱落血管内皮细胞相对计数（±s，100%）

注：与SO组比较，aP＜0.01

组别SO组SAP组3 h 6 h 12 h n 15 13 VEC相对计数28.2±1.3 35.4±3.1an 15 12 VEC相对计数29.1±1.1 43.3±2.7an 15 11 VEC相对计数29.2±1.4 54.8±3.8a

2.4 血清淀粉酶与胰腺病理评分的相关性及回归分析 将SAP组各时间点胰腺病理评分（表2）与血清淀粉酶分别作为X变量和Y变量，绘制散点图，两者之间有明显的正相关，见图2。用SPSS 13.0统计软件Spearman相关分析的相关系数r=0.351，P＜0.01。用SPSS 13.0统计软件行直线回归分析得直线回归方程Y=292.7X+5098，F=4.224，P＜0.01。2.5 循环内皮细胞与胰腺病理评分的相关性及回归分析 将SAP组各时间点胰腺病理评分（表2）与脱落血管内皮细胞数分别作为X变量和Y变量，绘制散点图，两者之间有明显的正相关，用SPSS13.0统计软件Spearman相关分析的相关系数r=0.842，P＜0.01，散点图如图3所示。用SPSS 13.0统计软件行直线回归分析得直线回归方程Y=21.227+ 4.837X，F=82.843，P＜0.01。

图2 SAP组各时间点胰腺病理评分与AMY散点图

图3 SAP组大鼠各时间点胰腺病理评分与脱落血管内皮细胞数散点图

3 讨论

急性胰腺炎(AP)是指多种病因引起的胰酶激活，以胰腺局部炎性反应为主要特征，伴或不伴其他器官功能改变的疾病。其中急性出血坏死性胰腺炎为胰腺存在炎症、出血、坏死、感染等局部病变，在此基础上迅速发展并表现为机体各系统功能损害的严重疾病[7]。当出血坏死性胰腺炎发生时，胰酶激活并释放入血，造成血胰淀粉酶升高，同时胰腺自身及肺、肝、消化道等器官的血管系统在炎症因子的作用下，内皮细胞出现坏死，并经血液循环代谢，以上两个指标升高的程度均与胰腺本身损伤程度有关。

成人因各系统发育成熟，不同机体对疾病的反应相似，容易评估病情并针对性用药，因此AP临床诊治方面在近年获显著进展，我国多次修订中国AP诊治指南，细化该病的诊疗。儿童因个体差异较大，儿童的临床体征因患儿表述能力、机体耐受力不同，常与病情不符。即使是同年龄组的患儿，体重、机体对抗应激的反应也存在差异，影响了AP时病情的评估及诊疗，目前的治疗包括补充体液、维持水电解质平衡、缓解疼痛、胰腺休息、支持治疗、调节血脂、血糖及血钙代谢、防止局部及全身并发症的发生、加强监护并反复评估疾病程度。通过多年的临床经验，我们总结出治疗胰腺炎“金标准”药物善宁的给药方程为：先由公式m2=0.035×kg+0.1得出体表面积，再根据公式100μg×m2/1.73 m2计算出第1个小时的输入量，后每小时按照剂量25μg×m2/1.73 m2输入，最少维持48～76 h，建议使用不超过7 d[8]。乌司他丁可以抑制坏死细胞释放出炎症因子造成的炎症反应，白蛋白竞争性抑制胰酶消化自体蛋白并帮助修复受破坏组织，均是儿童胰腺炎的必用药。在治疗过程中我们发现，单纯评估血胰淀粉酶升高水平、下降曲线不能及时、准确地反映体内炎症反应的程度及转归。不能为乌司他丁的应用剂量、给药频度提供精确参考。特别是白蛋白的应用指征、计量、用药时间都尚待商榷。这也是近年来我们在临床工作中遇到的难题之一。

在本实验中，我们选择了周龄16～18周的SD大鼠，这个生存期的大鼠正处于成年前期，各器官功能逐渐成熟，与儿童的生理功能相似。用这个周龄的大鼠能较准确的复制儿童出血坏死性胰腺炎的病理过程。在试验中，SAP大鼠血清淀粉酶水平与病理损伤程度之间存在正相关，计算出他们之间的相关系数r=0.351，P＜0.01，用SPSS13.0统计软件行直线回归分析得直线回归方程Y=292.7X+5098，F= 4.224，P＜0.01。同样病理损伤程度与脱落细胞间也是正相关关系，他们之间的相关系数r=0.842，P＜0.01，直线方程为Y=21.227+4.837X，F=82.843，P＜0.01。说明脱落细胞数量与病理损伤程度相关性更强。

经过此次动物实验可以大致估算：血淀粉酶升高3倍时[正常大鼠血淀粉酶为(1572.3±114.91)U/L，造膜3 h为(5431.25±758.47)U/L]病理损伤已经开始出现。此时乌司他丁给与量应较淀粉酶水平低于正常值3倍的加倍，并增加给药频率。白蛋白在应用指征、治疗剂量、给药时间等方面存在异议。目前一般掌握在胰腺周围出现渗液时给药。通过本次动物实验，可以推断出血淀粉酶升高到正常值3倍时，多器官的功能损伤已经出现。那么，可以确认临床上血淀粉酶升高超过正常值3倍即为给与白蛋白的指征。至于白蛋白输注量目前1 d不超过0.5g/kg，是否能满足高消耗性疾病的需要并修复机体完整性，尚需进一步实验确认。

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[2]陈朝红,刘志红,余晨,等.全身炎症反应综合症及脓毒血症患者内皮细胞功能研究[J].肾脏病与透析肾移植杂志,2003，4:352-353.

[3]Cosen-Binker LI，Binker MG，Negri G，et al.Acute pancreatitis possible initial triggering mechanism and prophylaxis[J].Pancreatology，2003，3(6):445-456.

[4]Hegyi P，Rakonczay Z，Jr.，Sari R，et al.L-arginine-induced experimental pancreatitis[J].World Journal of Gastroenterology，2004，10(14):2003-2009.

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[7]冉承茂，易小雷，易文君.全身炎症反应综合症和急性胰腺炎的相关性分析[J].中国普通外科杂志.2004,(13)6:463-465.

[8]王晓晔，谢艺，崔华雷.儿童急性胰腺炎的诊断、治疗及病因分析[J].中华小儿外科杂志,2012，33（1）:147-149.

（收稿：2014-04-06 修回：2014-07-06）

（责任编辑 张淑坤 屈振亮）

·作者须知·

计量单位的具体要求

组合单位符号中表示相除的斜线多于1条时应采用负数幂的形式表示，组合单位中斜线和负数幂亦不可混用，如ng/kg/min应采用ng·kg-1·min-1的形式，不宜采用ng/kg-1·min-1的形式。量的符号一律用斜体字，如吸光度（旧称光密度）的符号为斜体字“A”。在叙述中应先列出法定计量单位数值，括号内写旧制单位数值；如果同一计量单位反复出现，可在首次出现时注出法定与旧制单位换算系数，然后只列法定计量单位数值。血压仍以mmHg表示。参量及其公差均需附单位，当参量与其公差的单位相同时，单位只写一次，如：“750.4 ng/L±18.2 ng/L”可以写作“(750.4±18.2)ng/L”。

Relationship between Rat Circulating Endothelial Cells and Pancreatic Pathology Injury in Acute Hem-orrhagic Necrotizing Pancreatitis

ZHANG Bao-gang,WANG Xiao-ye,CUI Hua-lei.
Graduate School of Tianjin Medical University,Tianjin(300100),Chian

Objective To explore the relationship between rat circulating endothelial cells,serum amylase and pancreatic pathology injury in acute hemorrhagic necrotizing pancreatitis.MethodsThe acute hemorrhagic necrotizing pancreatitis models in rats were established by retrograding cholangiopancreatography injection of 5%sodium taurocholate.After the models were manufactured successfully,the rats were executed at 3 h,6 h, 12 h time points and the blood samples collected,the circulating endothelial cells were detected by flow cytometry,the activity of the amylase was checked by automatic biochemical analyzery.Then the correlation between pancreas pathology score and amylase levels was analyzed.ResultsAt 3 hours after successful modeling,the serum amylase was（5431.3±758.5）U/L,the pathological score was 3.3±0.8,the circulating endothelial cell count was 35.4±3.1%;and at 6 hours after successful modeling,the serum amylase was（6450.5±669.8）U/L, the pathological score was 6.3±0.9,the circulating endothelial cell count was 43.3±2.7;at 12 hours after successful modeling,the serum amylase was（7934.2±667.9）U/L,the pathological score was 3.3±0.8,and the circulating endothelial cell count was 54.8±3.8%.The correlation coefficient between serum amylase and pathological injury score was r=0.351,P＜0.01,the relationship equation was Y=292.7X+5098,the correlation coefficient between circulating endothelial cells and pathological injury score was r=0.842,P＜0.01,the rela-tionship equation was Y=21.227+4.837x.ConclusionThe amylase levels and the number of circulating endothelial exfoliated cells are positively correlated with the extent of damage when the body suffers in acute hemorrhagic necrotizing pancreatitis,but the latter is more relevant that can reflect the degree of multi-organ damage better.

Exfoliated cells;amylase level;pathological type;correlation

Q95-33;R657.5+1

A

1007-6948(2014)04-0400-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2014.04.020

天津市卫生局科技基金（2013K2036）

1.天津医科大学研究生院（天津 300074）

2.天津市儿童医院（天津 300074）

王晓晔，E-mail：wxygege@sina.com