重症急性胰腺炎肺损伤与肠道损伤的关系

张经文，陈海龙，王玉玺，王 超

重症急性胰腺炎肺损伤与肠道损伤的关系

张经文1，陈海龙1，王玉玺1，王 超2

目的：探讨重症急性胰腺炎大鼠肺损伤与肠道屏障损伤的相关性及中药清胰汤的保护作用。方法：40只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、清胰汤组和地塞米松组，真空干燥法测肺湿干比值，生化分析仪测血氧分压及淀粉酶含量，化学法测肺、肠组织中sPLA2的活性，TUNEL法测肠黏膜上皮细胞凋亡情况。结果：模型组大鼠血清淀粉酶含量（7208.8±264.6）U/L高于假手术组（1358.8±458.2）U/L,P＜0.05，模型组血TNF-α含量（180.53±20.1）ng/L，高于假手术组（59.67±14.3）ng/L,P＜ 0.05，模型组肺湿干比值（5.394±0.44）高于假手术组（3.866±0.34）,P＜0.05，模型组肠黏膜上皮细胞凋亡指数（0.256±0.06）高于假手术组（0.046±0.02）,P＜0.05，模型组血氧分压（54.56±7.78）mmHg低于假手术组（101.22±2.67）mmHg,P＜0.05，模型组较假手术组肺和肠组织中sPLA2活性明显升高，二者呈正相关关系（r=0.79,P＜0.05）；清胰汤组、地塞米松组较模型组大鼠胰腺、肺和肠组织损伤程度明显减轻。结论：重症急性胰腺炎时肺损伤与肠道屏障损伤间存在明显的正相关关系，清胰汤可以降低sPLA2的活性，对胰、肺和肠组织起保护作用。

重症急性胰腺炎；肠道屏障损伤；肺损伤；sPLA2；清胰汤

重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)时肺损伤的发生及与肠道屏障损伤的关系尤为引起人们的高度关注。分泌型磷脂酶A2（secreted phospholipaseA2，sPLA2)能大量降解肺表面活性物质，导致肺泡壁塌陷，还能降解肠黏膜细胞的磷脂成分，损伤肠道屏障。本实验通过同时观察中药清胰汤对SAP大鼠肺和肠组织中sPLA2活性影响，探讨肺损伤与肠道屏障损伤之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 sPLA2Assay Kit购自美国Cayman公司；TUNEL检测试剂盒购自南京凯基生物公司；TNF-α检测试剂盒购自美国R&D公司。清胰汤：由柴胡15 g，黄芩12 g，元胡15 g，木香15 g，白芍15 g，栀子15 g，大黄15 g(后下)，芒硝15 g(冲服)组成，由大连医科大学附属一院中药科熬制成质量体积比1∶1的药液，4℃保存。

1.2 动物模型及分组 雄性清洁SD大鼠40只，体质量为180～220 g，由大连医科大学清洁级实验动物中心提供[动物合格证号：SCXK(辽)2008—0002]。随机分为假手术组、模型组、清胰汤组和地塞米松组。SAP大鼠模型制备：经胆胰管内逆行注入1.5%去氧胆酸钠(1 mL/kg)30 s，注毕关腹。其中假手术组开腹轻翻胰腺后关腹；清胰汤组于造模前0.5 h、造模后6 h和12 h给予清胰汤以0.2 mL/kg灌胃；地塞米松组在造模后即刻、造模后6 h和12 h于尾静脉注射地塞米松l0 mg/kg。各组大鼠在造模后24 h麻醉下开腹，腹主动脉采血，同时迅速切取距回盲部近端1 cm肠组织和右上叶肺组织各100 mg，-80℃保存待测组织磷脂酶活性。

1.3 方法

1.3.1 各脏器标本病理切片观察 切取剩余胰腺、肠和肺组织，置入10%中性磷酸盐甲醛固定液中固定24 h后，液体石蜡包埋2 μm连续切片，常规HE染色后光镜下观察，胰腺组织病理变化参照Rongione评分法[1]、肺组织按Orlowski评分法[2]、肠组织按chiu评分法[3]进行单盲评分。

1.3.2 肠黏膜上皮细胞凋亡情况的检测 肠组织液体石蜡包埋后切片，按TUNEL法（末端脱氧核甘酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法）进行操作，高倍下（×400）随机选取5个视野，每500个肠黏膜上皮细胞中褐色阳性细胞所占的百分比，即为凋亡指数（AI）。

1.3.3 大鼠肺湿/干（W/D）比值 取整个左肺立即称重即为湿重，60℃烘干箱中连续烘烤24 h后，称重即为干重，记录代表肺水肿程度的肺湿/干（W/D）比值。

1.3.4 血清淀粉酶（AMY）含量及动脉血PaO2测定采用全自动生化分析仪检测，腹主动脉取血后立即测PaO2，其余血液提出血清后，1∶6纯水稀释测AMY含量。

1.3.5 血清TNF-α检测 按美国R&D公司TNF-α检测试剂盒说明书操做。

1.3.6 肺组织和肠组织sPLA2活性检测 使用美国Cayman公司sPLA2活性检测试剂盒。每50 mg肠黏膜上皮和肺组织加0.1 M Tris-HCL(pH7.5)500 μL超声振荡匀浆取上清，设空白孔2孔、阳性对照孔2孔和样品孔每份3孔。每孔加入200 μL底物，放入全自动酶标仪中，按试剂盒说明进行检测。

1.4 统计学处理 各检测数据用均值±标准差(x± s)表示，通过SPSS 13.0统计软件，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05具有显著性差异，采用Pearson积矩相关分析来说明各指标的相关性。

2 结果

2.1 大鼠一般情况 假手术组大鼠一般情况较好，24 h无死亡。模型组大鼠术后一般情况较差，出现竖毛、懒动、精神萎靡等表现，24 h死亡率为50%。清胰汤组和地塞米松组一般情况较模型组有改善，24 h死亡率40%，与模型组比较差异无统计学意义（P＞0.05）（见表1）。

表1 各组大鼠死亡率

2.2 组织病理学检查 光镜下，模型组胰腺小叶结构模糊，广泛坏死，肺泡壁塌陷广泛融合，透明膜形成，大量中性粒细胞侵润，肠黏膜上皮细胞大量脱落，肠黏膜结构严重破坏，较假手术组有显著差异（P＜0.01），而清胰汤、地塞米松组的组织损伤程度较模型组明显减轻，病理评分有显著差异（P＜0.05）（见表2）。

2.3 血清淀粉酶检测结果 与假手术组比较，模型组大鼠的血淀粉酶升高有显著差异（P＜0.01）。与模型组比较清胰汤组、地塞米松组血淀粉酶降低有显著差异（P＜0.05）（见表3）。

表2 各组大鼠胰腺、肺、肠组织病理评分(±s)

表2 各组大鼠胰腺、肺、肠组织病理评分(±s)

注：与假手术组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.05

组别 n假手术组 10模型组 5清胰汤组 6地塞米松组 6胰腺病理评分2.25±0.54 11.97±2.45a6.25±1.24b7.50±1.42b肺病理评分0.03±0.1 6.89±0.19a4.43±1.3b3.88±0.23b肠病理评分1.14±0.38 6.43±1.90a3.91±0.41b4.57±1.4b

2.4 动脉血氧分压测定结果 与假手术组比较，模型组PaO2显著下降（P＜0.05）。与模型组比较治疗组PaO2均有不同程度升高（P＜0.05），SAP造模成功后出现低氧血症（见表3）。

2.5 各组大鼠肺组织的湿干比值(W/D)与假手术组比较，模型组的肺湿干比值显著增高（P＜0.01）。与模型组比较，两治疗组的湿干比值值明显降低（P＜0.05）（见表3）。

2.6 血清TNF-α的变化 与假手术组相比较，模型组血清TNF-α含量显著升高(P＜0.01)。与模型组相比较，清胰汤组、地塞米松组血清TNF-α含量显著降低（P＜0.05）（见表3）。

表3 各组SAP大鼠AMY、PaO2、W/D、TNF-α、AI结果(±s)

表3 各组SAP大鼠AMY、PaO2、W/D、TNF-α、AI结果(±s)

注：与假手术组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.05

组别 n假手术组 10模型组 5清胰汤组 6地塞米松组 6 AMY(U/L) 1358.8±458.2 7208.8±264.6a4047.6±600.9b4914.4±200bPaO2(mmHg) 101.22±2.67 54.56±7.78a85.11±2.34b92.7±6.56bW/D 3.866±0.34 5.394±0.44a4.226±0.03b4.669±0.28bTNF-α(ng/L) 59.67±14.3 180.53±20.1a122.35±15.2b136.99±23.4bAI 0.046±0.02 0.256±0.06a0.134±0.02b0.16±0.02b

2.7 肠黏膜上皮细胞凋亡指数的变化 与假手术组相比较，模型组肠黏膜上皮细胞的凋亡指数显著升高(P＜0.01)。与模型组相比较，清胰汤组、地塞米松组肠黏膜上皮细胞的凋亡指数（AI）显著降低（P＜0.05），其中清胰汤组的AI降低更为明显（见图1，表3）。

图1 肠黏膜上皮细胞凋亡(TUNEL染色,×200)

2.8 肺、肠组织的sPLA2活性检测结果 与假手术组相比较，模型组大鼠肺和肠组织中sPLA2的活性均显著增高（P＜0.01）。与模型组相比较，两治疗组sPLA2活性明显降低（P＜0.05）（见图2）。

2.9 肠组织sPLA2活性与肺组织sPLA2活性、肺湿干比值的相关性分析 将反映肠道屏障损伤程度的肠sPLA2活性与反映肺组织损伤程度及肺水通透指标的肺sPLA2活性、肺W/D，进行Pearson相关性分析得出r值，可见肠sPLA2活性与肺sPLA2活性（r=0.79，P＜0.05）及肺W/D（r=0.819，P＜0.05）有明显正相关关系。

图2 各组大鼠肠、肺组织的sPLA2活性检测结果，与假手术组比较，aP＜0.01；与模型组组比较，bP＜0.05

3 讨论

SAP早期死亡的主要原因为急性肺损伤(acute lung injury，ALI)[4]。目前认为，SAP诱发ALI的发病机制是急性胰腺损伤后，引起TNF-α等炎性介质的大量释放，使肺毛细血管内皮细胞的屏障功能遭到破坏，出现以呼吸困难和低氧血症为主要表现的ALI[5]。同时学者们认为，肠道屏障功能损伤，是引发全身炎性介质过度表达的始动环节。我们发现，较假手术组，模型组大鼠肺湿干比值明显升高（P＜0.05），动脉血氧分压明显降低（P＜0.05），血清TNF-α含量明显升高，肠黏膜上皮细胞凋亡指数明显升高（P＜0.05），肠黏膜结构遭到严重破坏。这些指标的变化，也为上述理论提供了物质基础，说明肺损伤和肠道损伤具有明显正相关性，但二者之间的具体关系，还需进一步的分析。

祖国医学认为，肺与大肠一阴一阳，一表一里互相交合。其关系可概括为下：⑴肺主宣发是大肠得以濡润的基础。⑵肺主肃降，这是大肠维持正常传导功能的动力。⑶肺主通调,是保持大肠干燥的前提条件[6]。西医学同样认为，在胚胎期气管、支气管来源于原始肠道的一个皱壁。这种胚胎发育上的同源性,就为肺损伤和肠道屏障损伤的发病机制提供了许多相同的物质基础[7]。在SAP肺损伤时，激活的sPLA2不仅降解肺泡表面活性物质，引起肺不张和肺水肿，还能水解肠黏膜上皮细胞膜双磷脂结构，导致肠道屏障损伤。当肠道屏障损伤后，大量的内毒素入血，其能上调TNF-α等炎症因子的表达水平[8]，从而进一步加重肺泡结构破坏，导致肺通气换气功能障碍，出现低氧血症，肠组织的耐缺氧能力较弱，极易出现再次损伤。肺损伤和肠道屏障损伤二者相互影响，相互促进，加重全身组织损伤，甚至发展成为MODS。本实验发现，SAP模型建立24 h后，肺损伤严重，湿干比值明显升高的同时，肺sPLA2活性明显升高，并具有明显的正相关关系（P＜0.05），表明sPLA2在SAP所致ALI的发病机理中具有重要作用。与假手术组相比，模型组肠sPLA2活性明显升高的同时，与肠黏膜损伤程度和上皮细胞凋亡指数上升程度，具有明显的正相关关系（P＜0.05）。同时肠sPLA2活性，与代表肺损伤程度的肺W/D、肺sPLA2活性，也具有明显的正相关关系，进一步证实了肺损伤与肠道屏障损伤之间有着密切的联系，进一步支持了中医脏腑相关理论中“肺与大肠降表里”理论。

清胰汤以通里攻下、清热解毒、活血化瘀辅以益气营血为主要治则[9]。本实验以地塞米松作参照，发现清胰汤可使肺和肠组织sPLA2活性、肺湿干比值、肠黏膜上皮细胞凋亡指数明显降低，证实了清胰汤可以通过多途径、多通路对抗组织损伤，发挥其治疗作用。

肺损伤与肠道屏障损伤之间相互影响，互为因果，涉及细菌易位、炎性递质连锁反应等多个环节，治疗上仍缺乏有效措施。根据“肺与大肠相表里”的理论，中西医结合的综合治疗方法，可达到“釜底抽薪，菌毒并治”的目的，结合抗菌、抑酶、扩容、纠酸、免疫调节等常规疗法，适时应用外科引流、微创和介入治疗手段，可有效地保护肠道屏障，防止或减轻急性肺损伤的发生和发展。

[1]Rongione AJ,Kusske AM,Kwan K,et a1.Interleukin 10 reduces the severity of acute pancreatitis in rats[J].Gastroenterology, 1997,112(3):960—967.

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（收稿：2013-10-20 修回：2014-07-06）

（责任编辑 刘洪斌 屈振亮）

Relationship of Lung and Intestinal Injury in Rats with Severe Acute Pancreatitis

ZHANG Jing-wen, CHEN Hai-long,WANG Yu-xi,et al.
The First Affiliated Hospital of Dalian Medical University,Dalian (116011),China

Objective To observe the relationship of lung and intestine barrier injury in rats of severe acute pancreatitis(SAP)and to excavate the therapeutic action of traditional Chinese medicine Qingyi decoction（清胰汤）.MethodsForty healthy Spraghe-Dawley rats were randomly divided into sham operation,SAP,Qingyi decoction and Dexamethasone groups.Serum amylase，blood gas analysis，lung tissue W/D and lung tissue W/ D were measured to evaluate the severity of pancreatitis and(acute lung injury ALI).(secreted phospholipase A2sPLA2)activity of lung and intestine was measured by chemical method.The apoptosis of intestinal mucosal epithelial cells were used by TUNEL method.ResultsCompared with the sham group,the lung injury was serious in SAP group as evidenced by the results of serum amylase(7208.8±264.6 U/L vs 1358.8±458.2 U/L,P＜0.05),TNF-α concentration(180.53±20.1 vs 59.67±14.3 ng/L,P＜0.05),lung tissue W/D(5.394±0.44 vs 3.866±0.34,P＜0.05)and intestinal mucosal epithelial cell apoptosis index(0.256±0.06 vs 0.046±0.02,P＜0.05)were obviously promoted.The activity of sPLA2 in intestine and lung tissue was increased in the same index than those of lung and intestine(r=0.79,P＜0.05).Those indexes in Qingyi decoction group and Dexamethasone group were significantly lower than those in SAP group(P＜0.05).ConclusionThere is a positive correlation between lung injury and intestine barrier dysfunction in severe acute pancreatitis.Qingyi decoction group has an advantage in augmenting intestinal peristalsis and decreasing intestinal permeability and bacterial translocation by inhibiting the activity of sPLA2.

Severe acute pancreatitis;intestine barrier injury;acute lung injury;phospholipaseA2;Qingyi Decoction

R657.5+1

A

1007-6948(2014)04-0393-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2014.04.018

国家自然科学基金资助项目（81173452）

1.大连医科大学附属第一医院普外科（大连 116011）

2.临沂市人民医院（临沂 273400）

陈海龙，E-mail：hailongchen2007@163.com